沉默PDE4B对内毒素刺激的小胶质细胞内cAMP的影响

和晓韵，底 妍，张利东，刘 健，刘清珍，李伟彦，嵇 晴

近年来有研究发现神经胶质细胞活化在神经病理性疼痛的发生、维持中发挥着重要作用［1－2］，磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDE4)抑制剂能提高胶质细胞内的环磷腺苷(cyclic AMP，cAMP)水平，抑制细胞活化，减少炎性因子的产生［3－4］。PDE4存在4 种亚型(PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D)［5］，四种亚型在小胶质细胞内的分布、哪种亚型参与细胞内 cAMP的调节目前尚不清楚。本研究采用Western blot法观察4种亚型在小胶质细胞的分布情况;采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术分别特异性沉默相应的PDE4亚型基因，观察内毒素刺激前后小胶质细胞内cAMP的变化。

1 材料与方法

1.1 动物 新生SD大鼠(出生1～2 d)由南京军区南京总医院比较医学科提供。

1.2 材料 DMEM高糖培养基、PBS缓冲液、谷氨酰胺溶液、胎牛血清(Gibco，美国);多聚赖氨酸、LPS(大肠杆菌011:B4)(Sigma，美国);大鼠 cAMP试剂盒(R＆D Systems，美国);Anti-PDE4A 抗体、Anti-PDE4B抗体和Anti-PDE4D抗体(Abcam，美国);Anti-PDE4C抗体(Fabgennix，美国);Anti-rabbit IgG，HRP-linked 抗体(Cell Signaling Technology，美国)。

1.3 原代小胶质细胞分离 采用Xue等［6］所述的小胶质细胞培养方法，并略加改进。新生SD大鼠无菌条件下开颅取脑并剔除脑膜、血管及海马，取大脑皮层，预冷PBS缓冲液冲洗3遍后用1 ml枪头吹打，离心(1 000 r·min－1，10 min)，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基制成细胞悬液，细胞计数后按每瓶2×1011·L－1浓度接种于多聚赖氨酸预先包被的75 cm2培养瓶(Corning，美国)，37℃，5%CO2培养箱培养。d2换全液，后按细胞生长情况，每隔2～3 d半量换液。培养9～10 d，可见星形胶质细胞铺满培养瓶底层，上层散在大量形状不规则，透亮的小胶质细胞，密封瓶口，置于37℃恒温水平摇床内，以160 r·min－1振荡4 h，收集培养液，离心(1 200 r·min－1，10 min)，沉淀细胞加入DMEM培养基重悬并计数，按5×105/孔 密度将细胞接种于24孔板内，37℃培养箱内细胞黏附20 min，用PBS缓冲液清洗1次，最后加入含10%胎牛血清的高糖培养基37℃培养箱内孵育备用。

1.4PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D 蛋白表达水平测定 采用Western blot测定。细胞蛋白定量后，将总蛋白(50 μg)加入SDS上样缓冲液，煮沸5 min使其变性，经SDS凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭液(5%脱脂牛奶)室温封闭 1 h，分别加入PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D 一抗(1 ∶1 000，Anti-PDE4A 抗体;1∶1 000，Anti-PDE4B 抗体;1 ∶300，Anti-PDE4C 抗体;1 ∶500，Anti-PDE4D 抗体)4℃孵育过夜，TBST清洗5 min×6次，羊抗兔二抗(1∶1 000，Anti-rabbit IgG，HRP-linked 抗体)室温孵育lh，TBST清洗5 min×6次，暗室内加显色底物显色曝光，扫描。内参为GAPDH(1∶1 000，anti-GADPH rabbit antibody，Cell Signaling Technology，美国)。

1.5 siRNA的制备 由Invitrogen公司合成实验所需siRNA序列(Tab 1)，错配siRNA为Blockit Alexa Fluor Red Oligo，载体为 LipofectaminTMRNAiMAX，以上所有序列均由Invitrogen公司合成。

Tab 1 Sequence of PDE4A-siRNA，PDE4B-siRNA，PDE4C-siRNA and PDE4D-siRNA in the expreiment

1.6 细胞分组与转染 将培养细胞随机分为空白对照组、LPS组、单纯载体组、错配 siRNA组、PDE4A-siRNA 组、PDE4B-siRNA 组、PDE4C-siRNA组和PDE4D-siRNA组。转染前1 d将培养基更换为不含血清的高糖培养基。空白对照组和LPS组:细胞不进行转染;单纯载体组、错配 siRNA组、PDE4A-siRNA 组、PDE4B-siRNA 组、PDE4C-siRNA组和PDE4D-siRNA组分别给予LipofectaminTMRNAiMAX 1 μl，错配 siRNA、PDE4A siRNA、PDE4B siRNA、PDE4C siRNA 和 PDE4D siRNA 各 2 μl。转染前所有siRNA分别与1 μl LipofectaminTMRNAiMAX在100 μl无血清培养基中混匀 (siRNA终浓度为20 nmol·L－1)，室温放置15 min后逐滴加入细胞，每孔终体积为500 μl，置于培养箱中培养48 h。

1.7 PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D mRNA表达的测定 转染48 h后，采用RT-PCR检测PDE4A、PDE4B、PDE4C和 PDE4D mRNA的表达。按照RNA提取试剂盒［RNA isolation kit(Invitrogen)］的操作步骤进行总RNA提取，逆转录合成第1条cDNA。RT-PCR体系总反应量为20 μl，利用 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen，USA)试剂盒在实时定量PCR扩增仪上按照程序进行实时 PCR(95℃ 2 min 变性，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环)。反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线，分别计算各组 PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D mRNA的表达水平。

Tab 2 Primer sequence in the experiment

1.8 细胞内cAMP检测 采用ELISA测定细胞内cAMP的含量。(1)细胞转染48 h后，收集各组细胞;(2)转染48 h后，更换培养基，除空白对照组外其余各组加入含有LPS(100 μg·L－1)的无血清培养基500 μl/孔，刺激30 min后收集各组细胞。按照ELISA试剂盒指示测定cAMP含量。

1.9 统计学分析 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示。PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D蛋白及mRNA表达水平，细胞内cAMP表达水平均采用单因素方差分析，其后组间两两比较采用LSD检验。

2 结果

2.1 小胶质细胞内 PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D蛋白表达水平 采用Western blot法分别检测小胶质细胞内4种亚型蛋白表达水平。如Fig 1所示，小胶质细胞表达PDE4 4种亚型蛋白。

2.2 转染后小胶质细胞 PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D mRNA表达的变化 采用RT-PCR分别检测转染后各组的 PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D mRNA的表达，然后分别与空白对照组进行比较。如Fig 2A所示，与空白对照组相比，PDE4A-siRNA组PDE4A mRNA表达量明显下降，抑制率为(63.4±5.2)%(P＜0.05)，其他各组 PDE4A mRNA表达量无明显差异。PDE4B-siRNA组、PDE4C-siRNA组和PDE4D-siRNA组结果与PDE4A-siRNA组相似，抑制率分别为(65.3±6.4)%、(66.8±4.8)%、(72.5±7.0)%(Fig 2B、2C、2D，P ＜0.05)。

Fig 1 Protein expression of PDE4 subtypes in primary microglia assessed by Western blot Lane 1，2，3，4 represent four microglial cell samples.

2.3 LPS刺激前后小胶质细胞内cAMP表达的变化 如Fig 3所示，LPS刺激前，与空白对照组相比，转染后的各组细胞内cAMP的含量无明显变化(P＞0.05)。加入LPS刺激30 min后，与空白对照组相比各组细胞内cAMP的含量均明显增高(P＜0.05)，但与LPS组相比，仅PDE4B-siRNA+LPS组细胞内的cAMP含量明显升高(P＜0.05)，其余各组细胞内的cAMP含量差异无显著性(P＞0.05)。

3 讨论

活化的小胶质细胞介导的神经炎症在多种疾病中发挥重要作用。提高细胞内cAMP水平可抑制小胶质细胞的活化，LPS为体外实验中常用的小胶质细胞活化剂。既往有研究表明非特异性PDE4抑制剂可缓解神经病理性疼痛。因PDE4存在4种亚型，本研究采用Western blot法观察4种亚型在小胶质细胞的分布情况，并采用RNAi技术沉默相应亚型的表达，观察内毒素刺激前后小胶质细胞内cAMP变化。Western blot结果表明PDE4 4种亚型均在小胶质细胞内表达。

RNAi技术是利用双链 RNA(double stranded RNA，dsRNA)高效、特异性阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的过程［7］。本研究根据基因文库，分别设计了大鼠PDE4 4种亚型特异的siRNA序列，并采用脂质体包裹。RT-PCR结果显示:PDE4A-siRNA、PDE4B-siRNA、PDE4C-siRNA及PDE4D-siRNA只能抑制相对应亚型的mRNA表达，对其它亚型无效，证明实验选用的siRNA具有高效特异性。

Fig 2 Change of mRNA expression of PDE4A，PDE4B，PDE4C，PDE4D after transfection

Fig 3 Change of cAMP level before and after LPS stimulation

在测定细胞内cAMP含量的研究中，我们的结果表明无LPS刺激的静息状态下，抑制PDE4 4种亚型中的某一种并不能改变细胞内cAMP含量，可能是由于静息状态下4种亚型均参与cAMP的降解，单独抑制某一种亚型不影响基础cAMP水平。LPS刺激后，与空白对照组相比，细胞内cAMP水平反应性明显增高，但与LPS组相比，仅PDE4B亚型抑制后cAMP明显升高，而分别单独抑制PDE4A，PDE4C和PDE4D 3种亚型后细胞内cAMP与LPS组差异无显著性，说明LPS刺激对PDE4B亚型的影响远大于其它3种亚型，LPS刺激状态下，PDE4B可能在cAMP降解过程中发挥主要作用。

cAMP是广泛存在于多种细胞的第二信使，cAMP主要通过其下游蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、环核苷酸操控离子通道(cyclic nucleotide-gated ion channels，CNG)以及环腺苷酸直接活化的交换蛋白(exchange proteins directly activated by cAMP，Epac)3条途径调节细胞功能［8］。众多的研究提示，激活小胶质细胞内cAMP通路能抑制丝裂原刺激的细胞活化，可能是通过PKA和Epac途径［9－10］。

综上所述，RNAi技术能有效抑制PDE4B 4种亚型mRNA的表达，在细胞功能上进一步证实了PDE4B siRNA能有效增加LPS刺激后小胶质细胞内cAMP的含量。PDE4B将成为治疗慢性神经系统疾病的新靶点，至于在细胞水平及动物水平上PDE4B siRNA是否能有效减少炎性细胞因子的产生，从而达到治疗慢性神经系统性病变，还有待进一步研究。

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