PI3K/Akt信号通路在硫化氢保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤的作用

孟金兰，陈雅嘉，陈 红，董艳芬，邢德刚，梁燕玲，兰爱平，冯鉴强

(1.广东药学院生理学系，广东广州 510006;2.广州医学院荔湾医院体检科，广东 广州 510170;3.广州市

越秀区六榕街社区卫生服务中心药剂科，广东广州 510180;4.中山大学中山医学院生理教研室，广东广州 510080)

磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)可以磷酸化肌醇磷脂肌醇环上的3’-OH，其家族包括许多脂质激酶。Akt是原癌基因cakt的表达产物，它参与生长因子激活的经PI3K介导的信号过程，是神经元存活、神经和血管新生、轴突以及树突形成、突触结构形成和突触间信息传递所必需［1－2］。

PI3K/Akt信号转导通路具有调控物质代谢、基因表达、细胞迁移、增殖和存活等多种生物学功能，也是神经元存活的主要途径之一。当PI3K/Akt通路激活后不仅可以保护在体鼠脑缺氧缺血损伤［3］，而且也可抑制氧和糖剥夺诱导的皮层神经元凋亡［4］。由此看来，PI3K/Akt信号通路的激活对于保护神经元抗缺氧-缺血损伤尤为重要。

近年，本课题组［5－6］及其他学者［7］证实 H2S 具有神经保护作用，此作用机制可能与H2S的抗氧化作用，上调热休克蛋白90(Hsp90)及抑制p38MAPK(丝裂原蛋白激酶)等有关［5－7］。然而，H2S能否激活神经细胞PI3K/Akt信号通路?若可以，激活的PI3K/Akt途径是否介导H2S的神经保护作用?以上问题均未明了。

为此，本文应用化学性低氧模拟剂CoCl2损伤来源于大鼠嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞(其形态结构和功能特性与神经元相似)，给予 H2S供体NaHS预处理建立抗化学性缺氧损伤的神经细胞保护模型［6］。拟着重探讨:(1)H2S预处理能否激活PC12细胞PI3K/Akt信号通路;(2)PI3K/Akt信号通路是否介导NaHS预处理的神经保护作用，为进一步揭示新型气体分子H2S的神经保护作用的信号转导机制及防治缺氧缺血性脑病拓展新思路。

1 材料和方法

1.1 材料 NaHS、CoCl2、Ly294002购自美国 Sigma-Aldrich公司;CCK-8试剂盒购自日本 Dojindo Lab;DMEM培养基购自 Gibico公司;Akt、p-Akt抗体购自CST公司。PC12细胞由中山大学实验动物中心提供。

1.2 细胞培养 PC12细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。在37℃、5%CO2条件下培养，选取对数生长期细胞进行实验。

1.3 实验分组

1.3.1 探讨 NaHS干预 PC12细胞对 Akt磷酸化(P-Akt)水平的影响 实验分组:根据NaHS干预浓度将 PC12 细胞分为 0、50、100、200、400、800 μmol·L－16组，每组均干预30 min，分别检测NaHS对PC12细胞P-Akt水平的影响。

1.3.2 探讨 PI3K/Akt通路抑制剂 Ly294002对H2S神经细胞保护作用的影响 实验分组:(1)空白对照组(Control);(2)单独NaHS组(NaHS):单独应用 400 μmol·L－1NaHS处理 PC12 细胞 30 min。(3)CoCl2损伤组(CoCl2):应用 600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12细胞;(4)NaHS+CoCl2组:在CoCl2处理前30 min 加入400 μmol·L－1NaHS;(5)Ly294002+NaHS+CoCl2:在应用 NaHS前用15 μmol·L－1Ly294002 处理细胞 30 min，其余的实验步骤与(4)组相同;(6)单独 Ly294002组(Ly294002):应用 15μmol· L－1Ly294002 处理PC12细胞30 min。检测各组细胞p-Akt的表达及存活率的改变。

1.4 细胞存活率的检测 取对数生长期细胞，以1×104/孔接种于96孔板，在37℃、5%CO2条件下培养过夜后，更换为含有不同处理因素的培养基，每组设5个复孔。处理结束后各组细胞分别加入CCK-8(每孔100 μl加10 μl CCK-8)37℃孵育4 h，随后在酶联免疫检测仪测定每孔的吸收值(λ=450 nm)，按公式:存活率(%)=(实验组OD－空白对照组OD)/(正常对照组OD－空白对照组OD)×100%，求出实验组的存活率，重复3次。

1.5 PI染色流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡

细胞按实验要求给以不同的因素处理后，离心收集细胞，PBS洗2次，加入预冷的70%乙醇4℃固定过夜。用PBS洗2遍，PI染色后，用流式细胞仪检测细胞内DNA的含量(激发波长:488 nm;发射波长:610 nm)。每样本计数12 000个细胞，以DNA组方图中低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小代表凋亡细胞数的多少。

1.6 Western blot法检测p-Akt的水平 离心收集细胞。预冷的PBS洗涤2次，加入裂解缓冲液，4℃静置30 min。12 000×g离心10 min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1.5 h。随后加入p-Akt抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜，TBST洗3次，加入相应的二抗(羊抗兔IgG)，孵育1 h，漂洗3次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色后，用ImageJ 1.410进行灰度分析。

1.7 统计学处理 实验数据经SPSS 11.0统计软件进行统计分析，数据用±s表示，统计方法采用One-way ANOVA。

2 结果

2.1 NaHS对PC12细胞p-Akt水平的影响 应用不同浓度(50、100、200、400、800 μmol·L－1)NaHS干预 PC12细胞 30 min，观察 p-Akt表达情况。Western blot结果显示，在 50 ～ 400 μmol·L－1浓度范围内，呈浓度依赖性地上调p-Akt的水平，尤以400 μmol·L－1NaHS 干预时表达最高，为正常表达的2.7倍(Fig 1 A，B)(P＜0.01)，但当NaHS浓度为 800 μmol·L－1时，p-Akt水平尽管明显多于正常对照组(P＜0.01)，但比400 μmol·L－1组的明显减少(P＜0.01)。上述浓度的NaHS对总Akt水平无明显影响。

Fig 1 Effect of NaHS at different concentrations on the expression of Akt(±s，n=3)

2.2 PI3K介导了NaHS预处理诱导的Akt活化除受 PI3K激活外，Akt也受其它第二信使如Ca2+、cAMP的调节［8］。为了揭示 NaHS诱导的 Akt活化是否通过PI3K途径介导?我们在NaHS预处理前使用PI3K抑制剂Ly294002，检测其对p-Akt水平的影响。结果显示Ly294002抑制了NaHS预处理对p-Akt的上调作用(Fig 2)，提示PI3K通路参与NaHS预处理对PC12细胞Akt的活化。

2.3 PI3K/Akt信号通路介导H2S抗CoCl2诱导的细胞毒性作用 为了探讨PI3K/Akt途径在NaHS预处理抗CoCl2诱导的细胞毒性作用，在NaHS预处理前 30 min，给予 PI3K抑制剂 Ly294002(15 μmol·L－1)作用于 PC12细胞，观察 Ly294002能否拮抗NaHS预处理对细胞毒性的抑制作用。结果显示，NaHS预处理可以保护PC12细胞对抗600 μmol·L－1CoCl2引起的细胞毒性，能使细胞存活率从(55.90±3.5)%升高至(77.78±3.4)%(P＜0.01)。而在预处理前使用15μmol·L－1Ly294002，使 PC12细胞的存活率从(77.78±3.4)%降低至(56.20±3.6)%(P＜0.01)。400 μmol·L－1NaHS 及15 μmol·L－1Ly294002 本身并不影响PC12细胞的存活率。结果提示PI3K/Akt信号通路介导了H2S抗CoCl2诱导的细胞毒性作用。

Fig 2 PI3K mediates activation of、Akt induced by NaHS preconditioning(n=3)

2.4 PI3K/Akt信号通路介导H2S抑制CoCl2诱导的细胞凋亡作用 细胞凋亡时，由于DNA断裂，在细胞DNA分布图上的G1峰前可出现亚二倍体峰，即凋亡细胞所形成的凋亡峰。用流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡率，结果如Fig 4所示:PC12细胞经400 μmol/L NaHS 预处理后，可使 600 μmol/L CoCl2引起的细胞凋亡率由(35.7±1.1)%下降至(18.3±2.5)%(P＜0.01)，而预处理前使用Ly294002，细胞的凋亡率从由(18.3±2.5)%上升为(34.0±2.5)%(P＜0.01)，NaHS和 Ly294002本身没有诱导凋亡的作用(Fig 4)。

Fig 3 Effect of Ly294002 on increasing of cell viability induced by NaHS preconditioning(±s，n=5)

Fig 4 Influence of Ly294002 on anti-apoptosis induced by NaHS preconditioning(±s，n=3)

3 讨论

最近，本课题组证实，H2S预处理能保护神经细胞对抗化学性缺氧诱导的损伤作用［5－6］，其保护机制可能涉及多条信号通路。在多种实验模型，PI3K/Akt通路被证实是神经保护的。例如，在鼠脑局灶性缺血/再灌注(I/R)损伤模型，PI3K/Akt通路的激活可以显著减小脑损伤面积和神经元的凋亡数目［9］。激活的 Akt还可保护鼠海马神经元［10－11］及皮层神经元［4］对抗缺氧/复氧诱导的凋亡。

为了探讨PI3K/Akt通路是否参与H2S保护PC12细胞对抗化学性缺氧诱导的损伤作用，本实验首先观察H2S能否激活PI3K/Akt信号通路。研究结果表明，H2S供体NaHS呈浓度依赖性地引起PC12细胞Akt的活化。但是随着NaHS浓度的增加，对p-Akt水平的促进作用逐渐减弱，表明NaHS可以引起PC12细胞Akt的活化，但Akt的活化程度与其作用浓度有关。

为了证实Akt的活化是否由PI3K途径介导，本实验在NaHS预处理前给予PI3K的抑制剂Ly294002。Ly294002是PI3K特异的拮抗剂，在许多研究中被用来抑制 PI3K的活性［12］。Akt位于PI3K的下游，PI3K可使Akt发生磷酸化具有活性，当加入 PI3K抑制剂 Ly294002后，Ly294002裂解PI3K催化亚基 p110γ，并随后抑制激活的 p-Akt。本研究发现，Ly294002能抑制NaHS预处理对Akt的活化。表明在PC12细胞中，NaHS是通过PI3K途径引起Akt活化。新近研究结果也表明，NaHS可以促进离体鼠心脏［13］及内皮［14］等不同类型细胞PI3K途径依赖的Akt活化，支持本实验结果。

在上述研究基础上，本文进一步探讨PI3K/Akt通路是否介导NaHS预处理诱导的神经细胞保护作用。为了阐明这一问题，在 NaHS预处理前给予PI3K抑制剂Ly294002，细胞损伤检测结果表明，CoCl2明显降低了细胞存活率，增加了细胞的凋亡;NaHS预处理使PC12细胞提高对CoCl2的抵抗能力，增加了细胞的存活率同时减少了凋亡。但是在NaHS预处理前使用Ly294002，则拮抗了NaHS预处理的细胞保护作用，使细胞的存活率下降及凋亡率增加。提示PI3K/Akt通路介导了NaHS预处理抗化学性缺氧的细胞保护作用。本实验为深入阐明H2S的神经细胞保护作用机制提供了新颖的实验依据。

［1］Akama K T，McEwen B S.Estrogen stimulates postsynaptic density－95 rapid protein synthesis via the Akt/protein kinase B pathway［J］.J Neurosci，2003，23(6):2333 －9.

［2］Markus A，Zhong J，Snider W D.Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth［J］.Neuron，2002，35(1):65 －76.

［3］Li L，Qu Y，Mao M，et al.Phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway involved in regulation of hypoxia inducible factor lalpha in hypoxia ischemia brain damage of neonatal rats［J］.Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi，2008，22(9):1102 －7.

［4］Chung H，Seo S，Moon M，et al.Phosphatidylinositol-3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase-3 beta and ERK1/2 pathways mediate protective effects of acylated and unacylated ghrelin against oxygen-glucose deprivation-induced apoptosis in primary rat cortical neuronal cells［J］.J Endocrinol，2008，198(3):511 －21.

［5］Lan A P，Xiao L C，Yang Z L，et al.Interaction between ROS and p38MAPK contributes to chemical hypoxia-induced injuries in PC12 cells［J］.Mol Med Report，2012，5(1):250 －5.

［6］孟金兰，兰爱平，杨春涛，等.热休克蛋白90在硫化氢保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤中的作用［J］.中国药理学通报，2010，26(1):103－7.

［6］Meng J L，Mei W Y，Dong Y F，et al.Heat shock protein 90 mediates cytoprotection by H(2)S against chemical hypoxia－induced injury in PC12 cells［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2011，38(1):42－9.

［7］Kimura Y，Kimura H.Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stress［J］.FASEB J，2004，18(10):1165 －7.

［8］Yuan J，Yankner B A.Apoptosis in the nervous system［J］.Nature，2000，407(6805):802 －9.

［9］Wang H Y，Wang G L，Yu Y H，et al.The role of phosphoinositide-3-kinase/Akt pathway in propofol-induced postconditioning against focal cerebral ischemia － reperfusion injury in rats［J］.Brain Res，2009，1297:177－84.

［10］ Guo S Y，Yang G P，Jiang D J，et al.Protection of capsaicin against hypoxia－reoxygenation induced apoptosis of rat hippocampal neurons［J］.Can J Physiol Pharmacol，2008，86(11):785 －92.

［11］ Dai Z，Xiao J，Liu S Y，et al.Rutaecarpine inhibits hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in rat hippocampal neurons［J］.Neuropharmacology，2008，55(8):1307－12.

［12］ Wu J，Ding W G，Matsuura H，et al.Inhibitory actions of the phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor LY294002 on the human Kv1.5 channel［J］.Br J Pharmacol，2009，156(2):377 － 87.

［13］于 水，杨海扣，米 琰，等.PI3K/Akt信号通路在外源性硫化氢后处理大鼠离体心肌中的作用［J］.中国药理学通报，2010，26(6):759－64.

［13］ Yu S，Yang H K，Mi Y，et al.Function of PI3k/Akt signaling pathway in exogenous hydrogen sulfide postconditioning on isolated rat hearts［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(6):759 － 64.

［14］ Cai W J，Wang M J，Moore P K，et al.The novel proangiogenic effect of hydrogen sulfide is dependent on Akt phosphorylation［J］.Cardiovasc Res，2007，76(1):29 －40.