采前喷施拮抗菌罗伦隐球酵母对草莓保鲜效果的影响

毛淑波，朱 娜，韦莹莹，曹泽斌，雷 云，吴林蔚，屠 康

（南京农业大学食品科技学院，农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室，江苏南京210095）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）属蔷薇科草莓属，为浆果类水果。果实色泽艳丽、柔软多汁、营养价值极高，深受消费者喜爱。但其含水量高[1]，组织娇嫩，在采摘和贮运过程中极易受到机械损伤和微生物侵染而腐烂变质，因此不易贮藏和运输[2]。由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病及由匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）引起的软腐病是导致草莓果实采后腐烂的主要病害[3]。目前最主要的控制措施有气调、辐射、热、低温和化学药物处理等[4-5]。近年来，利用微生物防治果蔬采后病害已成为一种新的途径[6]。其中酵母菌由于具有抑菌谱广、拮抗效果好、遗传稳定、营养要求低，一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物，安全性高等优点而成为果蔬采后病害生物防治研究的热点[7-11]。由于部分的采后病原微生物早在果蔬田间生长时期就已经侵入花或者果实，而采前应用拮抗酵母菌可以减少果蔬在田间生长期间受到潜伏性病原菌的侵染，并有效防止果蔬采后贮运过程中病原菌的二次侵染[12]。因此，在果蔬采摘之前、田间生长时喷施拮抗酵母来抑制果蔬采后贮藏期间病害将是拮抗微生物应用的重要领域之一。罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）在果实表面具有较强的生长定殖能力，而且对田间环境和采后低温低氧及高CO2都具有很强的适应能力，比较适合采前应用。许多研究表明，采前应用拮抗酵母罗伦隐球能有效地减少梨[13]、甜樱桃[14]、葡萄[15]、番茄[16]、柑橘[17]等果实采后贮藏期间病害的发生。但是关于拮抗酵母采前喷施对草莓采后腐烂和品质的影响未见报道，本文通过研究采前应用罗伦隐球酵母对草莓采后病害的控制和贮藏品质的影响，以期为拮抗酵母的采前应用控制果蔬采后病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草莓果实 品种为“丰香”，种植于南京市江心洲白鹭生态园，种植期间大棚内昼夜温度范围约为8～25℃。

分析天平AR64CN 奥豪斯仪器有限公司；物性测试仪（质构仪）TA-XT2 英国Stable Micro Systems公司；台式pH计pH610 新加坡Trans Wiggens公司；数字折光仪TD-45 浙江托普仪器有限公司；色彩色差计CR-200 日本柯尼卡美能达控股公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备 拮抗酵母罗伦隐球（C.laurentii）的培养：由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供并置于4℃下NYDA（牛肉膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，琼脂15g，水1000mL）培养基上保藏，使用时从NYDA斜面上取一环于培养基平板上划线后在28℃下培养24h，再用接种环取一环于盛有50mL NYDB培养基（不加琼脂的NYDA）的250mL三角瓶中，在28℃下200r·min-1振荡培养24h。拮抗酵母菌悬液的制备方法是将培养好的酵母细胞于4℃、6000g下冷冻离心10min，并用无菌水清洗两次以去除培养基，之后用无菌水（含有0.05%Tween-80）将酵母细胞的浓度调整为108CFU/mL（CFU：菌落形成单位Colonyforming Units）。

病原菌的培养：灰葡萄孢霉（B.cinerea Pers.），为实验室保藏菌种，从自然发病的草莓果实表面分离得到，置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上生长或保存。使用前病原菌接种到PDA培养基上在26℃下活化培养7～10d之后，用无菌水（含有0.05%Tween-80）洗脱孢子，借助于血球计数板计数，调整至浓度为105个/mL的孢子悬浮液，备用。

1.2.2 果实采前喷施拮抗酵母实验设计 本次实验在南京市江心洲白鹭生态园进行，所选用的草莓果实品种为“丰香”，拮抗酵母（C.laurentii）菌悬液的浓度为108CFU/mL（含有0.05%Tween-80），对田间的草莓果实进行喷洒拮抗酵母。采用塑料小喷壶，并调节喷头以控制每次喷施量，使每次喷施量在0.5mL左右，将菌悬液均匀地喷施于草莓果实的正反面。

实验总共分为四个处理组：CK组：草莓果实商业成熟采摘之前不进行喷施；A组：草莓果实商业成熟采摘之前6d（始红期）用拮抗酵母菌悬液对草莓果实进行喷施；B组：草莓果实商业成熟采摘之前6d（始红期）+采摘当天（红熟期）分别用拮抗酵母菌悬液对草莓果实进行喷施；C组：草莓果实商业成熟采摘之前6d（始红期）+采摘之前3d（半红期）+采摘当天（红熟期）分别用拮抗酵母菌悬液对草莓果实进行喷施；每个处理组的草莓植株为65棵，草莓果实商业成熟后采摘，之后于2h内运回实验室，不同处理组的草莓果实分别放置于塑料盒中，并覆上保鲜膜以保持约95%的相对湿度。实验重复三次。

1.2.3 采前喷施拮抗酵母对草莓采后灰霉病和自然病害的防治实验 采摘回来的果实经过挑选之后分成两部分，一部分用于人工接种病害实验，果子用105个/mL灰葡萄孢霉孢子悬浮液浸泡5s，晾干后装入塑料盒，并用保鲜膜覆盖，用加湿器以保持95%的相对湿度，于20℃贮藏4d，测定果实的腐烂指数。另一部分用于自然实验，果实直接装入塑料盒用保鲜膜覆盖，20℃贮藏4d后测定果实的腐烂指数。腐烂指数的测定参照Cao等[18]的方法。每盒30个果实，每次处理30个果实。

1.2.4 草莓果实贮藏期品质指标的测定 采回来的草莓不接种病原菌，将果实置于20℃下贮藏4d，在采摘当天和贮藏4d后测定以下品质指标：失重率、硬度、颜色、可滴定酸含量（TA）、可溶性固形物含量（SSC）和维生素C含量。

失重率的测定：采用称重法，失重率（%）=（贮前果实质量-贮期果实质量）/贮前果实质量×100。

硬度的测定：采用TA-XT2i质构仪，探头直径为5mm，测前和测中速度为1m/s，测后速度为2m/s，下压距离为5mm，取最大力。每个果实取赤道部位2点，每组每次测定10个果实。实验重复测定三次。

颜色的测定：采用MINOLTA CR-200色彩色差仪测定果实表皮颜色的L*、a*和H值。每个果实测赤道部位左右对称四个点，取平均值。

可滴定酸含量（TA）的测定：用电位滴定法。用0.1mol/L的NaOH滴定至pH8.1，结果以含柠檬酸的百分数表示。

可溶性固形物（SSC）含量的测定：采用TD-45数字折光仪测定，每个水果测定3次，每组测定10个果子。实验重复测定三次。

维生素C含量的测定：采用钼酸铵比色法[19]。

1.2.5 拮抗酵母果实表皮生长动态测定 四个处理组的草莓果实采回来后不接种病原菌，分别置于外套保鲜膜的塑料盒中，于20℃下贮藏4d。分别在采摘当天和贮藏结束时测定拮抗酵母（C.laurentii）在草莓果实表皮的生长动态。每次测定时，从每个处理组分别随机抽取3个果实，称重，分别置于含有150mL无菌水的250mL锥形瓶中，然后在150r/min的摇床上振荡20min，接着将洗脱液进行梯度稀释，吸取0.1mL洗脱液并涂布于虎红琼脂平板上，并于28℃下培养2d，最后取出平板，根据酵母生长形态来计数（结果以lg CFU/g fruit表示）。

1.2.6 数据分析 实验数据处理采用SAS 8.2分析系统软件进行方差分析（ANOVA）和邓肯氏多重比较法（Duncan’s Multiple Range Test）在p=0.05的水平下进行检验。

2 结果与分析

2.1 采前喷施拮抗酵母对草莓果实采后灰霉病的防治效果

图1所示的是采前喷施拮抗酵母对草莓果实采后常温贮藏期间灰霉病防治效果。从图1中可以看出，随着拮抗酵母采前喷施次数的增加，草莓果实在贮藏期间腐烂指数明显降低。20℃贮藏4d后，对照组CK的腐烂指数达到了78.86%，处理组A和处理组B的腐烂指数显著地低于CK组（p＜0.05），而处理组C的腐烂指数仅为12.55%，比对照组CK减少了68.31%，同样显著地低于其余的两组处理（p＜0.05）。由此说明采前喷施拮抗酵母（C.laurentii）可以有效地降低草莓在室温环境贮藏下由于灰霉病引起的腐烂的发生，且C组效果最好。

图1 采前喷施拮抗酵母对草莓果实贮藏期间灰霉病的影响Fig.1 Effect of preharvest C.laurentii treatment on gray mold decay of strawberry fruit caused by Botrytis cinerea

2.2 采前喷施拮抗酵母对草莓果实采后自然病害防治效果

图2所示的是采前喷施拮抗酵母对草莓果实采后常温贮藏期间自然病害的防治效果。从图2中可以看出，CK组的草莓在20℃贮藏4d后的腐烂指数为44.33%，而处理组A的腐烂指数则为21%，相比于CK组，处理组A的腐烂指数显著降低了23.33%（p＜0.05）。处理组B的腐烂指数为11.33%，显著地低于CK组和处理组A（p＜0.05），而处理组C的腐烂指数仅为4.33%，明显低于其余的三组处理（p＜0.05）。由此可知，采前喷施拮抗酵母C.laurentii能显著降低草莓自然病害导致的腐烂，且C组效果最好。

图2 采前喷施拮抗酵母对草莓果实采后自然病害的影响Fig.2 Effect of preharvest C.laurentii treatment on natural decay of strawberry fruit

2.3 采前喷施拮抗酵母对草莓品质的影响

由表1可知，草莓经过常温贮藏后，各组果实的失重率均增加，但是采前喷施处理组的失重率均低于对照组，且处理组C与对照组之间存在显著差异（p＜0.05）。由此说明，拮抗酵母处理组能减少果实失重率，可能是由于采前喷施次数的增加，拮抗酵母在果实表皮定殖的数量增多，有利于其在果实表面紧密附着形成一层膜，以减少果实表面的水分蒸腾作用和果实的皱缩。

硬度是衡量果实品质的重要指标之一。在采摘当天，喷施处理组果实的硬度均高于对照组，但各组之间变化较小。贮藏结束后，对照组果实的硬度明显降低，而喷施处理组能维持较好的硬度。

随着贮藏时间的延长，草莓果实的可溶性固形物含量（SSC）、可滴定酸含量（TA）及VC含量均呈下降趋势。无论在采摘当天还是贮藏结束，各组之间的SSC和TA含量都没有显著差异，但贮藏结束后处理组B和C的VC含量显著高于对照组（p＜0.05），说明采前喷施拮抗酵母能显著延缓VC的下降。

表1 拮抗酵母采前喷施对采后草莓在贮藏前后的各品质指标的影响Table 1 Effects of preharvest C.laurentii treatment on quality parameters of strawberry fruits before and during 20℃storage

2.4 采前喷施拮抗酵母对草莓果皮颜色的影响

本实验通过测定L*、a*和H值来反映采前喷施拮抗酵母对草莓采后贮藏中的颜色变化影响。如表2所示，L*值代表果实的亮度，在采摘当天各处理组之间L*值差异不显著，经过常温贮藏4d后，各组的L值均下降但各处理之间差异较小（p＞0.05）。a*值代表果实的红度，贮藏结束后，各处理组a*值均有所增大，说明果皮颜色逐渐变红，但各处理组之间没显著差异（p＞0.05）。各处理组的H值在贮藏前后均降低，说明果皮颜色变暗，但是各组之间差异不显著（p＞0.05）。实验结果表明，采前喷施拮抗酵母对采摘当天及贮藏期间草莓果皮的颜色变化基本没有影响。

表2 拮抗酵母采前喷施对采后草莓在贮藏前后的颜色指标的影响Table 2 Effects of preharvest C.laurentii treatment on color indexes of strawberry fruits before and during 20℃storage

2.5 拮抗酵母在草莓果实表皮生长动态测定

同病原菌竞争营养物质和生存空间是拮抗酵母控制采后果蔬病害的主要作用机理[20-21]，将拮抗酵母在果蔬采摘之前使用，可以使拮抗酵母在采摘之前于果蔬表面定殖生长，并布满整个果蔬表面，有利于拮抗酵母在果蔬表面形成优势菌群，制造一个不利于病原微生物入侵的微生态系统[22]，从而有助于对果蔬采后贮藏期间病害的防治。

图3显示的是在采摘当天和贮藏结束时不同处理组草莓果实表面酵母菌的数量。由于草莓果实在田间生长时在其表面会自然生长一些拮抗微生物，其中包括酵母类微生物，因此生长动态测定实验中，对照CK组的虎红琼脂平板上也有酵母类拮抗微生物生长。在草莓果实采摘当天，A、B、C三个处理组果实表面酵母菌的数量级分别是4、5、5，且三个处理之间差异显著（p＜0.05）。此外，三个处理组草莓果皮表面定殖的酵母菌数量都明显地大于CK组（p＜0.05）。

图3 拮抗酵母在草莓果实表皮的生长动态Fig.3 Population dynamics of C.laurentii on the surface of strawberry fruit

相比于采摘当天，在贮藏期结束时，A、B二个处理组草莓果皮表面酵母菌的数量级上升，但都和采摘时处于同一数量级，但C处理组的酵母菌数量相比增加了一个数量级。同样，A、B、C三个处理组草莓果皮定殖的酵母菌数量随着采前拮抗酵母喷施次数的增多而增大的越多，且三个处理组之间也有显著差异（p＜0.05），并且，CK组草莓果皮定殖的酵母菌数量明显低于其他三个处理组（p＜0.05）。由图3可以发现，在本实验条件下，拮抗酵母采前喷施次数越多，其在草莓果实表皮定殖的数量就越多，越有利于其形成优势菌群，越能够发挥营养和空间的竞争作用来控制采后果蔬病害。

3 讨论

许多病原菌的侵染往往发生在果蔬田间生长期间，而采前应用拮抗酵母有利于拮抗菌先于病原菌定殖在果蔬表面，减少田间的潜伏性侵染和采摘及贮运过程中伤口处病原菌的侵染。在实验中，选择第一次喷施拮抗酵母的时间为采前6d，是因为此时草莓果实处于转色阶段，容易受到病原菌的侵染。实验结果表明采前喷施拮抗酵母（C.laurentii）能减少草莓果实采后灰霉病和自然病害的发生，Tian等[14]研究也发现采前喷施浓度为108CFU/mL的拮抗酵母（C.laurentii）能减少甜樱桃果实采后的病害。Larena等[23]认为采前喷施Epicoccum igrum两次以上才能减少桃果实采后的褐腐病。本实验研究结果也表明采前喷施拮抗酵母的次数越多，其控制病害的效果也越好。

品质参数是用来评价保鲜效果的一种重要指标，许多研究表明使用天然杀菌剂能减少果蔬采后病害，还能较好地维持果蔬采后的品质。Meng等[15]研究结果表明采前喷施拮抗酵母（C.laurentii）结合采后几丁质涂膜处理能减少葡萄在贮藏过程中的失重率。Castillo等[24]也发现采前应用芦荟汁液不仅能减少葡萄采后病害，还能降低果实的呼吸速率和失重率以及延缓果实色泽的加深和硬度的下降。本实验结果同样证实，采前应用拮抗酵母（C.laurentii）也能较好地维持草莓果实在贮藏过程中的品质。在采摘之前6d+采摘之前3d+采摘当天喷施拮抗酵母，能减少果实贮藏过程中的失重率，延缓硬度和VC的下降，但没能延缓果实色泽变暗以及可溶性固形物含量和可滴定酸含量的降低。

果蔬采后腐烂往往是由于病原菌侵染伤口所引起的，采前应用拮抗酵母有助于其更早地占领伤口位置，并快速消耗果实伤口处的营养使病原菌无法生长，从而在贮藏过程中能更持久的保护果蔬免受病原菌的侵染。采前喷施的时间和拮抗菌在果实表面的生长定殖能力对于其能否控制病害至关重要。研究发现采前喷施次数越多，拮抗酵母在草莓果实表面的定殖能力就越强。在采摘之前6d+采摘之前3d+采摘当天喷施拮抗酵母，有利于其在果实表面定殖。采前应用使拮抗酵母先于病原菌在果实表面生长定殖，并形成优势菌群，进而发挥其营养和空间竞争作用来抑制病原菌的生长，这可能是采前应用拮抗酵母控制果蔬采后病害的一个重要的机理。

4 结论

本实验研究发现采前喷施拮抗酵母（C.laurentii）能有效地降低草莓果实采后灰霉病和自然病害导致的腐烂。随着采前喷施次数的增加，果实贮藏过程中腐烂指数明显降低，且C处理组（采前6d+采前3d+采摘当天喷施拮抗酵母）控制果实采后腐烂的效果最好，常温贮藏结束后果实的腐烂指数比对照组减少了68.31%。因此，拮抗酵母的采前应用可以结合各果蔬果实的具体生长周期情况，适度的增加采前喷施次数，以防治果蔬采后贮藏期病害的侵染。

本实验中，采前喷施拮抗酵母（C.laurentii）还能较好的维持草莓采后常温贮藏期间的品质。采前喷施拮抗酵母能减少草莓果实的失重率，延缓硬度和VC的降低，但是对于草莓果实的颜色、可溶性固形物和可滴定酸含量无明显影响。

拮抗酵母在果蔬表面的生长定殖能力对于其能否应用于采前尤为重要。通过拮抗酵母（C.laurentii）在草莓果实表皮生长动态测定可以发现：随着采前喷施拮抗酵母的次数增多，其在果实表面的定殖数量也就增多，在采摘之前6d+采摘之前3d+采摘当天喷施拮抗酵母，有利于其在草莓果实表面定殖。

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