二乙基亚硝胺诱导小鼠肝癌的时钟基因表达变化

金涛，文国容，金海，陆远富，刘杰，3＊

（1.遵义医学院药理学教研室及贵州省基础药理重点实验室，遵义 563000；2.遵义医学院附属医院消化内科；3.University of Kansas Medical Center，Kansas City，KS 66160，USA）

原发性肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年新发肝癌患者约60万，居恶性肿瘤第5位。目前我国的发病人数约占全球的半数以上，已成为严重影响我国人民健康和生命的一大杀手。近年来有研究发现肿瘤的发生和发展与时辰节律也存在一定的关联性。哺乳动物的多种生理、生化行为都表现出一定的节律变化，并受到时钟基因的调控。时钟基因不仅参与正常组织基因的表达而且也通过对致癌基因、抑癌基因和内分泌通路的影响，多方面参与肿瘤的发生与发展［1］。国内外常用二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN）来诱导建立肝癌动物模型［2］，以达到模拟人体肝癌病变过程。本文亦通过DEN诱导建立肝癌模型来检测正常组织、癌组织、癌旁组织中时钟基因的表达，进一步探讨时钟基因在DEN诱导肝癌情况下的变化。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN）购自天津化学试剂研究所；Trizol购自TakaRa公司；High Capacity Reverse Transcriptase Kit购自Applied Biosystems，Foster City，CA，USA；Power SYBR Green PCR Master Mix购自Takara公司；美国 BIO－RAD 荧光定量 PCR 仪，仪器编号：20050034；德国Eppendorf多功能梯度PCR仪，仪器编号：20050017；北京普析通用仪器有限责任公司TU－1810 紫 外－可见分光光度计，仪器编号：20040425。

1.2 方法

1.2.1 动物及分组 18只健康C57BL／6J小鼠，雄性，体质量18～22g，购自重庆第三军医大大坪医院实验动物中心。动物许可证号：SCXK（渝）2012－0001。饲养于光照－黑暗12h交替（光照期6：00～18：00）的SPF程控环境，自由饮水进食，动物房室温维持在23℃左右。适应性喂养1w后全部小鼠随机分为正常组6只，肝癌组12只。

1.2.2 造模及取材 参考有关文献［3］，取肝癌组小鼠先一次腹腔注射DEN 100mg／kg，3d后以CCl4和橄榄油（20∶80）灌胃，0.05mL／10g，2次／w；第3周再腹腔注射DEN 1次（50mg／kg），同时开始给予含有9%乙醇的饮用水，第4周加大CCl4剂量至0.08mL／10g，正常组仅自由饮用灭菌普通水，观察两组小鼠活动情况，连续16w后于10：00处死动物。取正常组（正常组织）、肝癌组（癌旁组织和癌组织）组织备用。

1.2.3 Real－Time RT－PCR 检测基因的表达 取50～100mg的正常肝组织、癌旁组织、癌组织分别置于1mL Trizol中匀浆，加入200μL的氯仿，震荡混匀，12 000r／min，4℃离心10min。吸取上清300μL转入另外去酶EP管中，加等量异丙醇混匀后，12 000r／min，4℃离心10min，弃去上清，使用75%乙醇（DEPC水配置）在7 500r／min，4℃离心5min情况下洗涤2次，室温干燥后加入100μL DEPC水。利用TU－1810紫外－可见分光光度计测其260／280比值，检测其纯度和浓度。采用 High Capacity Reverse Transcriptase Kit逆转录纯化的RNA，所得cDNA利用特异引物（见表1）进行实时定量PCR扩增，反应条件参照试剂盒说明书进行。利用G3PDH对各基因的表达进行归一化处理。

表1 实时荧光定量PCR底物序列

图1 肝脏巨检及实时荧光定量PCR检测正常组织、癌旁、癌组织中AFP表达。±s，n＝12，与正常组比较，＊P＜0.05

图2 实时荧光定量PCR检测正常组织、癌旁、癌组织中Bmal1、Dbp和Rev－ErbαmRNA表达。±s，n＝12，与正常组比较，＊P＜0.05

1.2.4 统计学分析 所有数据应用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析（one－way ANOVA），组间比较用LSD检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脏组织巨检及肿瘤标志基因AFP mRNA的表达

肝癌组在16w后巨检发现肝表面凹凸不平，散在直径大小不等的结节（见图1）。甲胎蛋白（Alpha Fetoprotein，AFP）是原发性肝癌的高特异性和高灵敏度的肿瘤标志物。经实时荧光定量PCR结果显示，AFP mRNA在癌组织中高表达，约为正常组织表达量10倍（P＜0.05）（见图1），提示肝癌组小鼠已被成功诱发肝癌。

2.2 时钟基因mRNA的表达

本实验组已成功检测出时钟基因Brain muscle ARNT－like protein 1（Bmal1）、albumin site D－binding protein（Dbp）和 Nuclear receptor Rev－erb alpha（Rev－erb）在正常雄性昆明小鼠中 mRNA表达的节律性变化（见图2）。本实验10：00取材的正常肝组织中Bmal1表达较高，Dbp和Rev－Erbα表达较低；而同正常组相比较，Bmal1在癌旁组织、癌组织中的表达明显下调（P＜0.05），下降到正常组的1／3；Dbp和 Rev－Erbα在癌旁组织、癌组织中mRNA的表达显著上升（P＜0.05），达到正常组的2～4倍（见图2）；癌旁组织与癌组织差异无统计学意义。

3 讨论

本实验结果显示，小鼠正常肝脏组织的时钟基因表现出一定的节律变化，Bmal1基因的表达量在10：00较高，Dbp和 Rev－Erbα在10：00仅有少量表达。这与本实验组近期的研究结果［4，7］相一致。经DEN诱导C57BL／6J小鼠肝癌形成的条件下，其癌旁组织和癌组织的时钟基因的节律已显示出紊乱。Bmal1基因表达量显著下调，Dbp和Rev－Erbα的表达量明显上升。

节律性的生命活动广泛存在于各种生物体中，从单细胞生物到植物、动物直至人类，都受到时钟基因的调控。目前已知有很多的时钟基因参与了生物体节律活动的调节，如：Bmal1、Dbp和 Rev－Erbα等。Bmal1在哺乳动物生物钟的转录、翻译反馈环中以异源二聚体的形式激活Dbp、Rev－Erbα发挥重要作用。Dbp、Rev－Erbα表达蛋白入核又反过来抑制Bmal1的转录，由于基因转录和蛋白入核需要一定时间，这样就使被调控的基因呈现出生物节律［5］。亦有研究［6］表明Rev－Erbα对维持昼夜节律的长度和相位是必须的，并与Dbp及其它因子共同组成钟控基因小组，用以控制其下游的时钟基因。而生物的节律活动并不是仅依靠时钟基因来实现的，本实验组发现药物代谢关键酶细胞色素P450、金属硫蛋白和抗氧化基因同样存在昼夜节律［4，7］，提示了生物节律的重要性。

时钟基因与其它基因共同作用参与机体的多种生理功能和疾病的病理过程，如：血压和心肌缺血显示出节律性［8］，下丘脑肽类物质胃肠肽、促胃液素等也显示出昼夜周期节律变化［9］，这都与时钟基因的正常调控存在密切联系。更为重要的是时钟基因能够影响细胞的增殖周期和凋亡、神经内分泌和免疫功能，这些都与肿瘤的发生、发展关系密切。因而时钟基因的紊乱有可能促使肿瘤发生，加速肿瘤的发展［10］。大量研究表明时钟基因的紊乱可增高乳腺癌发病率和结肠癌的发生机会，同时与造血系统肿瘤的产生也存在着一定的相关性。亦有研究显示在乳腺癌患者中发现褪黑素的周期性改变，在卵巢癌、胃癌中激素分泌存在昼夜节律的改变。本实验结果清楚显示在小鼠肝癌组织中时钟基因表达发生了紊乱。究竟是肝癌的发生改变了时钟基因的节律性，还是时钟基因的紊乱促进了肝癌的发生，或二者均存在，这需要进一步的研究去证实。

DEN在整个诱癌过程中经历肝细胞损伤再生到硬化直至癌变的过程，与人类肝癌发生的经历阶段类似［11］，从而弥补了临床标本的不足，为研究肝癌的发生、发展提供基础。本实验在采用DEN诱导小鼠肝癌形成的条件下，检测出时钟基因在癌组织和癌旁组织显示出紊乱，为时钟基因与肿瘤的发生、发展关联性的研究提供了一定的实验依据。

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