通脑饮对大鼠脑梗死组织血管神经再生的影响

韩 漾,吴明华,马 立,梁 森

(1.南京中医药大学,南京 210029;2.江苏省中医院脑病中心,南京210029)

脑梗死,又称缺血性卒中,中医称之为卒中或中风,主要表现为神经功能缺损症状而严重影响中老年患者身心健康和生活质量的脑血管疾病,其中缺血性脑梗死占43.7%～78.9%[1]。其主要特点是高发病率、高致残率、高病死率、高复发率,为社会及家庭带来严重经济负担。采用中药早期治疗,可预防脑梗死进一步进展。本实验旨在为中药制剂通脑饮(组成:天麻、钩藤、石斛、川芎、赤芍、制南星、天竺黄、僵蚕、地龙、水蛭)提供实验室研究依据。

1 实验材料

健康成年雄性SD大鼠(由南京中医药大学动物实验中心提供)24只,体质量(300±30)g,随机分为假

手术组8只,模型组16只。参照《现代神经科学研究方法》[2]中所述的线栓法制作大鼠大脑中动脉局灶性缺血再灌注(MCAO)模型。假手术组手术步骤基本同MCAO模型大鼠,但只分离、暴露血管,不结扎颈总动脉及颈外动脉,不插入钓鱼线。将模型组大鼠于术后随机分为对照组8只和给药组8只,经24 h后分别通过灌胃给药法给予等量等渗生理盐水或通脑饮(江苏省中医院提供),4 mL/次,2次/d,共14 d。

2 实验方法

2.1 神经功能测定 参照《现代神经科学研究方法》[2]采用神经功能缺损评分标准(NSS),每组均设4个时间点,于术后2 h,1 d,7 d,14 d进行评价。评分标准:无任何异常行为,0分;提起鼠尾,健侧前肢内旋、肩内收为损伤较轻,1分;上述症状基础上,置于光滑平面,向健侧推挡时阻力减弱或动物转圈追尾爬行,为中度损伤,2分;提起鼠尾,向患侧旋转,损伤较严重,3分;动物处于精神抑制状态,不能进行自发活动,4分。0分及4分的大鼠不予入组。

2.2 荧光定量PCR法检测VEGF,bFGF,SDF-1,CXCR4基因表达水平 至14 d,模型组中每组选取3只断颈处死,按照试剂盒说明提取细胞总RNA,并逆转录成cDNA,根据SYBRGreenⅠ说明书进行荧光定量PCR扩增。PCR引物序列如下。VEGF,P1:5’-CAAAG CCAGCACATAGGAGAGA-3’,P2:5’-CTATCTTTCTTTGGTCTGCATTCAC-3’,PCR 产物为 71 bp;bFGF,P1:5’-CATCAAGGGAGTGTGTGCGA-3’,P2:5’-CCAGTTCGTTTC AGTGCCAC-3’,PCR 产 物 为 174 bp;SDF-1,P1:5’-GCATCAGTGACGGT AAGCCAG-3’,P2:5’-GCAACAATCTGAAGGGCACA-3’,PCR 产物为 7 133 bp;CXCR4,P1:5’-ACACCGTCAACCTTTACAGCA-3’,P2:5’-CAGGGATAGTC AGGAGGAGGG-3’,PCR 产物为 165 bp;rat actin,P1:5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’,P2:5’-TTT AATGTCACGCACGATTTC-3’,PCR产物为150 bp。PCR扩增反应体系 :模板 25 μ L,上 、下游引物各1 μ L,Sybr green I(20 ＊)0.5 μ L,模板 ＊(cDNA)2 μ L,DEPC,20.5 μ L,总反应体积为50μ L。扩增条件的设置:94℃预变性4min,94℃变性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循环35次,72℃检测信号。荧光定量PCR仪:FTC2000(Canada)。所有样本均重复检测3次,计算出Ct值。

2.3 统计方法 应用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据均已均数±标准差(±s)表示,采用单因互方差分析,再用 LSD法进行 2组之间均数比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 神经功能评分 术后2 h、1 d、7 d、14 d,对照组评分分别为(2.5±0.5),(2.6±0.5),(1.8±0.3),(1.6±0.5)分;治疗组分别为(2.7±0.5),(2.6±0.5),(1.5±0.5),(1±0.5)分;假手术组无神经功能缺损症状,见图1。

由图分析可知:对照组大鼠神经功能缺损在1 d达到高峰,有自发恢复趋势;治疗组大鼠神经功能缺损随时间逐渐改善,以术后7 d后改善显著。2组各个时间点采用 t检验,分别为:0.33,1,0.04,0.03,可见通脑饮能明显改善大鼠急性脑梗死后的神经功能功能缺损。

3.2 荧光定量PCR检测结果 治疗组与对照组脑梗死组织中的VEGF,bFGF,SDF-1,CXCR4的CT值与内参CT值检测结果,并对各CT值采用2-△△CT进行标准化处理,得到各基因的相对表达量,对照组:(0.479±0.128),(0.140±0.028),(0.469±0.108),(6.082±1.534),治疗组:(0.982±0.134),(0.259±0.030),(0.959±0.191),(12.002±1.888),见图 2。对各基因相对表达量行独立样本 t检验,P均<0.05。由上可知,治疗组较对照组大鼠脑梗死组织中VEGF,bFGF,SDF-1,CXCR4基因表达量明显增加,差异具有统计学意义。假手术组大鼠无脑梗死症状。

图2 荧光定量PCR检测结果

4 讨论

中医学的“中风”包含西医范畴的缺血性脑梗死、脑栓塞、脑出血等,其基本病机总属阴阳失调,气血逆乱。其病理因素不外虚(阴虚、血虚)、火(肝火、心火)、风(肝风、外风)、痰(风痰、湿痰)、气(气滞、气逆)、瘀(血瘀)六端,脑卒中急性期最多见的症候是风证、瘀证、痰证,痰瘀互结是脑卒中急性期发作后的基本病机,可见脑卒中急性期,应予息风化痰、活血化瘀为主[3],《医学衷中参西录》中也明确指出:“化其脑中瘀血,方能奏效”。痰瘀阻络方通脑饮,以经典方剂涤痰汤、天麻钩藤饮和通窍活血汤化裁加减而成,具有平肝息风与活血化痰共治作用,使痰化而血行、血行则痰清,气血流畅,以达治疗之效[4]。此方经过临床疗效观察,如吴明华等[5]对40例患者应用此方并进行临床观察,证实其能显著改善急性脑梗死患者的临床神经功能缺损,提高日常生活活动能力。

众所周知,缺血性脑梗死后可造成严重的神经功能的缺失,这种神经功能的缺失是由于各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍,导致脑组织缺血缺氧性病变坏死。缺血缺氧是触发血管生成的重要因素,血管生成的启动需要众多细胞因子的参与,主要包括血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、基质细胞衍生生长因子-α(SDF1-A)与其受体CXCR4。VEGF是一种特殊的内皮细胞因子,具有神经营养、神经保护、抗凋亡等作用,与脑组织缺血损伤关系密切[6]。陈林等[7]经实验研究结果示VEGF因子的表达1/2 h出现上调,并在24 h达到高峰,随后表达有所下降,在168 h时表达又有所增加。bFGF在体内广泛分布,具有很强的生物学活性,其促进新的血管形成,bFGF诱导内皮细胞形成血管是通过VEGF来实现的。在低氧状态下,碱性成纤维细胞生长因子可促进培养的血管平滑肌细胞VEGF的表达。SDF-1-CXCR4轴可通过干扰SDF-1-CXCR4轴使干细胞有骨髓流出进入外周血液循环,到达缺氧缺血性脑损伤部位,EPC能在缺血区分化成成熟的血管内皮细胞,促进新血管形成,从而改善缺血组织的血液供应[8]。SDF-1/CXCR4轴同时也能促进血管增生,表现在在SDF-1与VEGF之间存在相互作用,VEGF能够诱导内皮细胞中SDF-1的表达,而SDF-1也能诱导VEFG的表达。

本实验通过建立大鼠MCAO模型,神经功能评分明确通脑饮对于大鼠神经功能恢复有积极作用,并通过荧光定量PCR检测证实通脑饮可上调VEGF,bFGF,SDF-1/CXCR4基因表达,初步明确了通脑饮可促进急性脑梗死后血管的再生。

[1]李卫征,郝子龙,吴波.急性缺血性卒中溶栓治疗进展的循证医学证据[J].中国现代神经疾病杂志,2009,9(5):414-416.

[3]赵杨,虞鹤鸣.中风中医特色疗[M].北京:人民军医出版社,2012:96-99.

[4]江淑婷,吴明华.天麻通脑饮治疗急性脑梗死痰瘀阻络证的临床疗效观察[J].疑难病杂志,2011,10(5):328-330.

[5]吴明华,胡华白,张秀胜.自拟痰瘀阻络方治疗急性脑梗死痰瘀阻络证的临床疗效观察和磁共振波谱分析[J].四川中医,2012,30(9):60-61.

[6]章露易,陈忠.VEGF与中枢神经系统疾病的关系[J].浙江大学学报,2009,38(6):644-648.

[7]陈林,陈绍华,陈继英.SD大鼠脑梗死急性期血清HIF-1α、VEGF因子的变化特点及相关性研究[J].乐山师范学院学报,2012,27(12):13-18.

[8]李士勇,邓宇斌.SDF-1/CXCR4轴在缺氧缺血性脑损伤中的研究进展[J].生命科学,2008,20(3):463-466.