亚麻脱胶菌发酵条件的优化及酶的粗提

薛小华，丁若垚，郁崇文，张兴群

(东华大学生态纺织教育部重点实验室，上海201620)

亚麻是人类最早使用的天然植物纤维，亚麻脱胶即亚麻粗纱煮炼，目的主要是去除部分黏结单纤维的胶质，利于亚麻工艺纤维进一步分劈，进而提高亚麻工艺纤维的可纺性，但粗纱化学煮炼能耗高，形成的废水对环境污染严重。相比传统的化学脱胶方法，亚麻生物脱胶是一种绿色环保的脱胶方法，它具有提高精干麻质量，不损伤纤维，无污染等优点。前文报道了脱胶细菌在亚麻粗纱煮炼中的初步应用［1］，通过试验探讨了假单胞菌DA10发酵液用量、初始pH值、煮炼温度和处理时间对细菌煮炼的影响。通过假单胞菌DA10脱胶后亚麻纤维失重率、强度、细度参数的测定，表明经DA10菌脱胶的亚麻，纤维损伤较小，保证了亚麻纤维品质，符合纺纱的工艺要求，并达到了绿色环保的效果。在此基础上试图通过对亚麻快速生物脱胶菌株DA10发酵温度、pH、发酵时间等条件进行正交优化，探明该菌株的快速生物脱胶发酵条件，并通过脱胶对其发酵条件优化进行验证，为寻求最佳的脱胶工艺参数，形成实用的“亚麻快速生物脱胶技术”奠定基础。生物脱胶技术成本低，并已在亚麻［2］、苎麻［3］、大麻［4］等纤维的脱胶中使用。同时，脱胶菌所分泌的酶要比商业酶在成分上更全。针对于此，本研究通过盐析分级沉淀的方法从亚麻脱胶菌DA10发酵液中粗提取亚麻脱胶酶，并测定相应的酶活得到各个酶硫酸铵盐析的饱和度范围，进行大量的脱胶酶盐析沉淀，并与发酵液脱胶进行对比，为亚麻脱胶酶进行亚麻脱胶奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

菌种:由实验室自行筛选得到的一株亚麻脱胶菌，即假单胞菌DA10。

原料:原麻来自湖北精华纺织集团有限公司;亚麻粗纱来自浙江金鹰集团有限公司。粗纱中纤维的性能:纤维线密度1.15 tex，束纤维强度33.90 cN/tex。

设备:智能控制恒温摇床 (ATS－051D/052D，上海堪鑫ChemStar仪器设备有限公司)、手提式压力蒸汽灭菌锅 (YXQ SG41 280)、BOXUN超净台 (洁净等级:100，上海博讯实业有限公司)、真空冷冻干燥机 (上海实维实验仪器技术有限公司)、高速冷冻离心机 (日立Hitachi高速冷冻离心机)、TF020型Sirolan－tensor束纤维强力仪 (澳大利亚SIROLAN公司)、Y171C型纤维切断器、JN－B型精密扭力天平 (量程10 mg，分度值0.02 mg)等。

培养基:种子培养基为牛肉膏蛋白胨培养基;发酵培养基为亚麻培养基K2HPO41g，MgSO40.5g，亚麻粉 5g，(NH4)2SO45g，KCl 0.5g，H2O 1000ml，pH 7.0 －7.2。

1.2 实验方法

1.2.1 活化菌种，制备种子液

将冷冻保藏在－20℃下的DA10菌种保藏液取出，在无菌条件下，接种到装有200ml种子培养液 (牛肉膏蛋白胨培养液)的锥形瓶中。37℃、200r/min下培养12h。

1.2.2 发酵

将200ml种子培养液接种到2000ml原麻培养基中 (即扩大10倍)，按照正交实验［5，6］设计方案即在不同条件下进行发酵培养。由前期实验得出影响较大的因子是温度、时间和初始pH，故对三个影响因子进行正交实验。

1.2.3 酶活性测定

DNS法［7］测定发酵液中纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶的活性。

1个酶活力单位定义为:酶反应最适温度下，每小时水解底物产生1mg单糖所需的酶量，以U/ml表示。即:

式中:U—酶活力单位 (U/ml);

G—酶解液中还原性醛基含量 (mg);

N—酶液稀释倍数;

V—加酶液量 (ml);

t—酶解时间 (h)。

1.2.4 硫酸铵盐析

将发酵完毕的亚麻培养基发酵液均分至离心管中，8000rpm离心15min，弃去沉淀，将上清液收集至大烧杯中用20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%饱和度的硫酸铵逐级盐析发酵液，对上清液进行取样测定相应的果胶酶和木聚糖酶活，获得果胶酶和木聚糖酶盐析曲线。选择最适盐析范围进行大量盐析，获得大量酶。

1.2.5 冷冻干燥

将获得的各种酶放入冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，取出称取相应质量。

1.2.6 纤维线密度测定

纤维线密度的测试方法为中段切断称重法。所切取纤维的长度为20 mm，所称取纤维的质量为7.5～8.3 mg(折算成公定质量)。每个试样测试3次取平均值作为测试结果。

1.2.7 束纤维强度测定

1.2.8 正交试验设计

表1 因子水平表Tab.1 Factors and levels designed for fermentation

如表1，选择3因子3水平正交试验方法对影响发酵的因素进行优化设计。

1.2.8 扫描电镜分析

本试验使用DXS－10A普及型智能化扫描电子显微镜进行测试。加速电压为2kV－30kV，最大放大倍数为50000倍。

2 结果与分析

2.1 正交法对多因子发酵条件

2.1.1 发酵初始pH、发酵温度、时间的正交试验

由极差分析法得出各个影响因子对亚麻脱胶菌DA10发酵的影响程度，极差R1的大小顺序均为A ＞B＞C即影响纤维素酶因子的主次关系为:发酵时间＞温度＞pH。R2，R3的大小顺序均为B＞A＞C。即通过果胶酶活，木聚糖酶活皆表明:影响亚麻脱胶菌DA10发酵的诸因素的主次关系依次是pH＞温度＞发酵时间。

图1 不同水平下各因子对纤维素酶，果胶酶和木聚糖酶酶活的趋势图Fig.1 Curves of cellulase，pectinase and xylanase activities under different factors and levels

表2 正交实验结果Tab.2 Orthogonal experimental results

亚麻脱胶主要去除果胶和半纤维素，保留纤维素。依据酶的特异性，理论上纤维素酶活越小越好，果胶酶活和木聚糖酶活越大越好。故果胶酶的最优条件是A2B3C1，木聚糖酶的最优条件是A2B2C2。

从表4可以看出：采用本文自制的压力环传感器测试斜拉索的索力与采用加速度传感器测试的索力吻合情况良好，随着索力的增加，两者之间的误差也越来越小。这表明本文提出的压力环传感器测试索力的方法是可靠的，压力环传感器性能稳定，测试结果准确。同时从表4中可以看出：压力环传感器的测试结果较加速度传感器的测试结果大。由于受到实验室条件的限制，本文的斜拉索索长均较短，根据现有文献可认为加速度传感器的测试结果误差较大，这也在一定程度上反映了压力环传感器测试结果的精度较高。

由于亚麻脱胶关键酶是果胶酶和木聚糖酶，且纤维素酶活性相对较低和稳定，即对亚麻脱胶影响相对较小，故主要对果胶酶和木聚糖酶进行研究并作为主要考察因素。

由正交试验结果得到以下三种相对较优发酵条件，并对其进行脱胶实验验证。发酵及煮炼参数如表3所示。

表3 因子水平表Tab.3 Factors and levels designed for degumming

图2 发酵条件对纤维强度，失重率，分裂度的影响趋势Fig.2 Trends of fiber strength，weight loss rate and splitting degree under different fermentation conditions

综上，测定结果可以明显得出亚麻脱胶菌DA10的最优发酵条件为:发酵初始pH值为7，发酵温度为40℃，时间为12h。

图3 最佳发酵条件下煮练纤维扫描电镜图Fig.3 Fibers scanned on electron microscopy(SEM)under the best fermentation conditions

2.2 硫酸铵盐析法对混合酶粗提取

图4 盐析后上清液果胶酶酶活曲线Fig.4 Curve of pectinase activity

由图4可知，盐析后上清液在硫酸铵饱和度为50%的时候，果胶酶相对酶活力开始急剧下降，至90%饱和度时基本接近平缓，故说明硫酸铵饱和度在50%至90%区间内可大量析出果胶酶。

图5 盐析后上清液木聚糖酶酶活曲线Fig.5 Curve of xylanase activity

由图5可知，盐析后上清液在硫酸铵饱和度为20%的时候，木聚糖相对酶活力开始急剧下降，至40%饱和度时基本接近平缓，故说明硫酸铵饱和度在20%至40%区间内可大量析出木聚糖酶。

2.3 细菌煮炼与酶脱胶对比结果

图6 不同酶对亚麻粗纱失重率，分裂度及强度的影响趋势Fig.6 Trends of weight loss rate，splitting degree，and strength of flax roving under different enzymes

由图可以明显看出，亚麻粗纱煮炼的总体效果:碱煮＞粗提混合酶 (果胶与木聚糖酶混合)＞发酵液＞商业单一酶。

3 小结与讨论

3.1 通过正交实验方法对亚麻脱胶菌DA10发酵条件的研究，可以得出以下结论:pH对亚麻脱胶菌的发酵影响最大，其次是温度，而时间对其影响相对较小。亚麻脱胶菌假单胞菌DA10发酵的最适条件是:发酵初始pH值为7，发酵温度为40℃，时间为12h。

3.2 通过硫酸铵盐析法得到的盐析曲线的趋势表明:硫酸铵饱和度在50%至90%区间内可大量析出果胶酶;硫酸铵饱和度在20%至40%区间内可大量析出木聚糖酶。

3.3 粗提混合酶亚麻粗纱煮炼的效果分别与纯碱煮、发酵液和其他商业酶对比得出:粗提混合酶各项参数与碱煮相当，比发酵液和其他商业单一酶高，粗提混合酶对亚麻粗纱煮炼效果相对较优。生物处理亚麻粗纱对比纯碱煮炼，亚麻纱明显变得柔软，表面也变得光滑，源于生物作用的温和且污染较小。

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