基于近红外光谱测定复方盐酸阿米洛利片有效成分的含量

陈久艳，方敏，吴再珍，杨宏，周群刚，#，谢洪平#（.苏州大学医学部药学院，江苏苏州252；2.苏州市立医院，江苏苏州 25002；.苏州市中心血站，江苏苏州 25006）

复方盐酸阿米洛利片为盐酸阿米洛利及氢氯噻嗪的复方制剂，主要用于心力衰竭、肝硬化等引起的水肿及腹水与高血压病等的治疗。复方盐酸阿米洛利片的含量测定在2010年版《中国药典》中是采用高效液相色谱（HPLC）法[1]，文献[2-4]也有采用HPLC法和紫外光谱法的报道。本文基于多元校正的偏最小二乘（PLS）法[5]，利用近红外光谱技术，在样本不经任何预处理的条件下，建立了一种将该复方制剂中两组分快速、同时测定的方法，实现了复方盐酸阿米洛利片的快速质量评价，具有简单、快速、准确的特点。

1 材料

傅立叶变换NEXU红外光谱仪，配有积分球漫反射采样系统（美国Thermo Electron公司）。

盐酸阿米洛利原料药（批号：11103001，纯度：100.3%）、氢氯噻嗪原料药（批号：11101002，纯度：98.7%）均来自江苏迪赛诺制药有限公司；复方盐酸阿米洛利片（某厂提供，批号：110801、110701、111101，规格：每片含盐酸阿米洛利2.5 mg、氢氯噻嗪25 mg）。

2 方法与结果

2.1 样本制备与近红外光谱测定

以处方为依据，将辅料与两组分（原料药）进行混合，制备成41个混合样本，在每个样本中两组分的含量均不同，盐酸阿米洛利为1.5840%～2.5682%、氢氯噻嗪17.1223%～23.8857%（以质量分数计）。上述含量范围为占标示量百分含量的80%～120%，包含了该制剂的法定含量范围（即占标示量百分含量的90%～110%）。分别将上述粉末混合样本直接装入普通的青霉素玻璃瓶中，充分振摇均匀，并在实验台面反复振动使其尽可能紧密堆积，同时检测近红外光谱，若前后2次检测的光谱相关系数为1.0000时，即得待测样本。

利用积分球漫反射技术测定待测样本的近红外光谱，以3次测定的平均光谱作为样本的光谱。光谱采集条件：扫描次数32次、分辨率8 cm－1、光谱范围10000～4000 cm－1、以聚四氟乙烯为光谱扫描背景材料。

2.2 光谱预处理

分别测定41个混合样本的近红外光谱，原始光谱见图1A。

图1 41个样本近红外光谱Fig 1 NIR spectrums of 41 samples

从图1A中无信息光谱区间9000～10000 cm－1处可见该样本光谱明显发生了漂移，用基线校正的方法对光谱进行预处理，可有效地消除基线漂移，使光谱的变化仅反映样本组成和含量的变化，见图1B。

2.3 建立盐酸阿米洛利、氢氯噻嗪的PLS法定量分析多元校正模型

在41个混合样本中，以样本组分含量均匀分布为原则，用29个样本构建校正集，其余样本构建预测集。以“剔一”交互检验法确定最佳主因子数，得盐酸阿米洛利和氢氯噻嗪的定量分析多元校正模型的最佳主成分数均为9。以29个混合样本的近红外量测光谱在9000～4000 cm－1范围内的吸光度为变量，利用PLS法在盐酸阿米洛利含量与多个吸光度之间建立校正模型，见图2A；同法建立氢氯噻嗪的校正模型，见图2B。

图2 实际含量与预测含量关系曲线Fig 2 Relationship curves of actual contents and predicated ones

以样本量测光谱的吸光度为变量，利用所建立的组分的校正模型，计算该样本中组分的含量。对于被测样本，据此即可实现组分的含量测定。对于建立模型的29个校正集样本，根据模型计算获得的含量与样本中的实际含量，即可计算获得他们之间的相关系数和均方根残差。计算得盐酸阿米洛利和氢氯噻嗪的相关系数均为0.9962，均方根残差分别为0.0252、0.1735。表明2个模型具有较为理想的拟合能力，能够良好地反映实际样本中含量的统计行为。而对于另外的12个预测集样本，盐酸阿米洛利和氢氯噻嗪的相关系数分别为0.9902、0.9903，均方根残差分别为0.0516、0.3548。从上述参数可知，所建立的2个模型具有良好的预测能力。

2.4 重复性试验

取同一待测样本重复测定6次，分别用建立的校正模型计算盐酸阿米洛利和氢氯噻嗪的含量。结果，盐酸阿米洛利、氢氯噻嗪的RSD分别为1.2230%、0.9916%，表明方法重复性良好。

2.5 稳定性试验

取同一待测样本连续测定5 d，分别用校正模型计算盐酸阿米洛利和氢氯噻嗪的含量。结果，盐酸阿米洛利、氢氯噻嗪的RSD分别为0.7196%、0.3698%，表明样本稳定性良好。

2.6 回收率试验

分别取高、中、低水平的3个样本，每个样本按“2.1”项下方法重复测定3次，分别用校正模型计算盐酸阿米洛利和氢氯噻嗪的含量。以实际含量为基础，计算该复方制剂中两组分的回收率，结果见表1（表中含量与回收率的“%”为质量百分比）。

表1 回收率试验结果（n＝3）Tab 1 Results of recovery tests of samples（n＝3）

从表1的回收率和相应的RSD结果可知，本方法有良好的准确度。

2.7 含量测定

取某厂的3批次样本，分别测定光谱，用建立的校正模型分别计算盐酸阿米洛利和氢氯噻嗪的含量。结果3批样本中盐酸阿米洛利占标示量的百分含量分别为104.14%、104.27%和103.53%，氢氯噻嗪分别为97.40%、97.28%和97.78%。

另按2010年版《中国药典》复方盐酸阿米洛利片“含量测定”项下[1]的HPLC法，分别测定3个批次样本盐酸阿米洛利和氢氯噻嗪的含量，相应结果分别为：盐酸阿米洛利102.58%、102.01%和100.62%，氢氯噻嗪94.84%、96.04%和95.56%。与本方法的测定结果比较，两者之间存在1.24%～2.91%的偏差，从一般性原则分析，这样的方法学偏差范围是合理的。

3 讨论

3.1 粉末样本混合均匀程度与堆积紧密程度

在样本的制备过程中，每个样本中组分的混合均匀性以及样本间堆积紧密程度的一致性是保证测定准确性的主要因素。按41个样本设计的要求，分别将2个待测组分和辅料置于青霉素玻璃瓶中，在充分倒置混合后，不断振动使其粉末尽可能堆积紧密，并测定近红外漫反射光谱。若经2～3次重复操作后，样本光谱重叠，且光谱相关系数为1.0000时，认为此时样本达到了混合均匀和尽可能紧密的程度，将此时的样本作为待测样本。

3.2 青霉素玻璃瓶对样本光谱的影响

为了考察样品瓶的不均匀性对样本光谱的影响，对于同一样本先后采用不同的样品瓶按“2.1”项下方法混合并测定其光谱。结果发现不同样品瓶中的同一样本光谱能够达到完全重叠，光谱相关系数为1.0000。由此可见，青霉素玻璃瓶之间的差异性对研究体系准确度不构成影响，可以将样本粉末直接装入此类瓶中测定。

3.3 近红外光谱快速分析与药典HPLC方法的比较

对于本文建立的复方盐酸阿米洛利片近红外光谱快速分析方法，从上述的方法学考察能够充分地说明该方法可准确测定两组分的含量。本方法的回收率（96.70%～106.06%）能够满足药品含量测定指导性原则对“回收率的一般要求”，即90%～110%。当然上述要求是对国家药品标准的一般要求。而近红外光谱药物分析方法在现阶段是不适宜作为“国家药品标准”方法，而适宜于生产过程和药房贮藏过程中对药品质量的常规检控，其显著特点是快速性和非破坏性。

为了进一步说明本文所建立方法的可靠性，按《中国药典》标准的HPLC法对3个批次样本进行了含量测定，结果两者之间存在1.24%～2.91%的偏差。虽然这种偏差的数值不大，但是其所表现的是“HPLC法的结果较近红外光谱偏小1.24%～2.91%”，这可能是由于2种方法的固有性质所决定的。HPLC法是在组分分离基础之上的分析方法，表现出高度的专属性；而近红外光谱分析是在所有干扰组分共存条件下，利用多元校正分析建立多波长定量模型的分析方法，是由多波长下的多变量检测信号的组合而实现方法的专属性。上述偏小的结果预示着后者的专属性略微弱于前者，也正是由此决定了近红外光谱分析主要适用于药物的非破坏性快速分析，而不适宜作为国家药品标准分析。

基于PLS法，笔者利用近红外漫反射光谱分析技术建立了复方盐酸阿米洛利片中盐酸阿米洛利和氢氯噻嗪这2种有效成分含量的快速、简单、不经任何样本预处理过程的测定方法，实现了该复方片剂含量的直接测定。结果表明，该方法准确可靠，模型具有较强的预测能力、良好的稳定性和适应性，可用于该制剂质量的快速评价。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：586-587.

[2]费培根，杨水新.高效液相色谱法测定复方盐酸阿米洛利片的含量[J].中国医院药学杂志，2004，24（1）：33.

[3]王锋，王伟佳.高效液相色谱法测定复方盐酸阿米洛利血药浓度[J].今日药学，2011，21（2）：81.

[4]吴军，李新霞，陈坚.光纤药物在位溶出度/释放度监测仪实时监测复方盐酸阿米洛利片体外溶出度[J].药物分析杂志，2007，27（2）：238.

[5]梁逸曾，俞汝勤.化学计量学[M].北京：高等教育出版社，2003：125-127.