人蛋白酶体α亚基3型 （PSMA3）对促细胞凋亡蛋白分子Bim的影响

鄢 进 （武汉大学基础医学院，湖北 武汉430071；复旦大学生命科学院，上海200433）

陈金中，王臻臻，夏 鹏 （复旦大学生命科学院，上海200433）

黎七雄 （武汉大学基础医学院，湖北 武汉430071）

蛋白酶体能抑制细胞凋亡，而蛋白酶体抑制剂MG132诱导人血管内皮细胞凋亡［1－3］。PSMA3基因在Bim凋亡调节蛋白起什么作用，有何影响，目前尚未见文献报道。因此，本研究的主要目的是探究PSMA3基因在Bim蛋白中的调节作用，研究PSMA3调节Bim蛋白对细胞凋亡的影响，阐明蛋白酶体与细胞凋亡的关系，为研究蛋白酶体抑制剂有效的刺激或诱导细胞Bim的表达水平上调，为疾病的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要药品及试剂 QIAquick的胶回收试剂盒，由德国的Qiagen公司提供；QIAquiekPCR的纯化试剂盒，由德国的Qiagen公司提供；硝基纤维素膜 （Hybond－C），由美国Amersham Pharmacia Biotech公司提供；常规质粒的快速提取的试剂盒，由北京博大泰克生物基因技术有限责任公司提供；DNA片段／PCR产物的快速纯化以及回收试剂盒，由北京博大泰克生物基因技术有限责任公司提供。

使用的电泳各项试剂均系Bio－Rad产品；纯化蛋白使用的琼脂糖凝胶珠Ni－NTTA由Novegen公司提供；DNA与蛋白Markers由New England Biolabs公司提供；各种内切酶如EeoRI、BamHI、Xhol、Hindlll等，T4DNA的连接酶，由英国Biolab公司提供；过硫酸胺，由美国Sigma公司提供；考马斯亮蓝的R250／G250，由美国AMRESCO公司提供；兔抗人的bimL的多克隆抗体，由美国Santa Cruz公司提供；兔抗人的PSMA3的多克隆抗体，由美国Santa Cruz公司提供；分析纯，Tris碱，由美国Boehringer Mannheim公司提供；Dulbecco's modified Eagle's medium （DMEM）由美国 Gibco公司提供；其他的常用试剂是国产分析纯试剂dNTPs，由上海生工生物工程公司提供。分子量蛋白标准，由中国科学院上海生化所提供；TaqDNA的聚合酶，由上海生工生物工程公司提供。以上所有的引物都是由上海赛百盛公司合成。

大肠杆菌的DH5菌株：基因型SupE44，pcDNA3.0，由美国的Invitrogen公司提供；pcDNA4／myc－his的系列，由美国的Invitrogen公司提供；绿荧光表达的载体pEGFP－Cl，由美国的Clonteeh公司提供；真核表达的载体pcDNA系列，由美国的Invitrogen公司提供；红荧光表达的载体pDsRedl－N1，由美国的Clonteeh公司提供；HEK293、PSMA3及BIM由复旦大学遗传学国家重点实验室提供。

1.1.2 主要仪器 哈尔滨 HZQ－C摇床，德国 Mastercyclergradien Eppendorf PCR仪，日本Olympus显微镜，上海 HHS－U99水浴锅，日本 Hitachi 20PR－52D离心机，美国550Bio－Rad酶标仪，德国Eppendorf 5415DEppendorf台式离心机，上海SDJ超净工作台，美国Power3000Xi Bio－Rad蛋白电泳仪，美国Mini－100Bio－Rad蛋白电泳槽。生物电泳凝胶成像及扫描分析软件：Smart View3.0.Origin Pro6.0software.Annutating Grabber－1T2.51及 UVP Gelworks ID Advanced Version。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在37℃，5%CO2的环境下用培养皿，将10%胎牛血清加入到含双抗的DMEM的培养基中，常规培养293T细胞。

1.2.2 真核表达载体的构建 PSMA3的基因首先设计特异引物通过PCR扩增，再将PCR的产物纯化，经过双酶切，包括真核表达的载体也要进行双酶切，酶切以后通过连接转化，再做阳性克隆鉴定，最后送公司进行测序和分析［4］。

1.2.3 质粒的小量提取 对筛选的单克隆菌落的小瓶培养菌液，吸取1.5ml菌液，放在Ep管中，12000g，离心2min，取菌体沉淀。加入SolutionⅠ100μl，用移液器吹打沉淀，直到打散为止。加入SolutionⅡ200μl，轻混摇匀，冰浴5min。加入SolutionⅢ150μl，振荡混匀，冰浴5min。12000g，离心2min，吸取400μl上清液，转移在新的Ep管中，加880μl无水乙醇，混匀室温放5～30min。12000g，离心2～5min，弃去上清液，用70%的乙醇清洗得到的DNA，弃上清，室温干燥后，加入TE缓冲液溶解20μl，4℃保存。

1.2.4 其他 质粒瞬时转染、亚细胞定位、细胞蛋白抽提、Western blot检测和免疫共沉淀方法均按文献 ［4］操作。

2 结 果

2.1 应用PlexA－bimL技术从人胎脑PB42AD文库筛选PSMA3

常见的3个Bim异构体：Bim S／L／EL，三者的促凋亡作用依次减弱，在细胞内Bim主要是以BimL／EL的形式存在。我们在研究过程中选用促凋亡效应中等的Bim L来进行研究。从人胎脑pB42AD文库中筛选到121个阳性克隆，其中阳性克隆出现超过一次以上的基因有下列11个，经过测序验证，和Blastn基因库数据比对发现，它们所代表的基因分别为：MIF、PMSB4，GRB10、PMSA3、 Ferritin Heavy Chain、 TUBB5、 CTBP2、 CGI99、 SART3、S100、LOC199990（见表1）。

表1 人胎脑PB42AD文库筛选PSMA3结果

我们对其中的NM－002788所代表的人蛋白酶体亚基产生了浓厚的兴趣。此基因位于1q21，mRNA为1014bp，含有7个外显子，编码的蛋白是30KD大小，且主要分布于细胞的胞核、胞浆中，主要执行苏氨酸内肽酶的分子功能，在生命过程中参与泛素依赖性的蛋白分解代谢。

2.2 光共聚焦测定PSMA3和Bim胞质的分布

用pEGFP－C1－BimL／pDsRed－PSMA3在HEK293T中过表达检测亚细胞定位情况，如图1所示，在同一视野不同的荧光下拍摄的照片，可以看出pEGFP－C1－BimL转染效率要高于pDsRed－PSMA3。在共转染的细胞中，荧光显示Bim在细胞胞质中分布，而PSMA3则是颗粒状的分布在细胞胞质中，融合蛋白主要分布在细胞核核膜的周围。荧光共聚焦实验提示，PSMA3和Bim在细胞内的空间上存在相互作用可能性。

图1 荧光共聚焦测定PSMA3和Bim胞质的分布

2.3 PSMA3对Bim蛋白表达的影响

实验组将质粒PEGFP－BimL／pCMV－MYC－PSMA3共转入 HEK293T细胞，对照组共转pEGFp－BimL／pCMV－MYC，proteinA／G用兔抗pEGFP抗体孵育，免疫沉淀pEGFP－BimL，用鼠抗MYc抗体检测MYc－PSMA3。PSMA3能增加HEK293t细胞胞质中Bim L的表达，同时，胞内过表达的Bim L能与过表达的PSMA3也存在相互作用。

3 讨 论

细胞凋亡是一种进化保守的细胞死亡形式，不仅在正常的生理状态具有重要作用，而且与多种疾病的发生发展密切相关。近年来研究认为，细胞凋亡异常可能与肿瘤发生有关。凋亡调控基因已被看作是一类新的肿瘤发生相关基因。肿瘤的发生是由于细胞增殖与细胞凋亡之间的平衡失调的结果，细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用，因此，研究抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡而对正常细胞影响不大是肿瘤治疗的新思路［5－6］。

为了研究线粒体依赖性凋亡过程中Bim潜在的分子调节机制，通过筛选胎脑文库，克隆到一个未曾报道过的并能与Bim相互作用的蛋白分子——人蛋白酶体α亚基3型 （PSMA3）。应用显微共聚焦和免疫共沉淀的技术，我们证实了PSMA3和Bim在细胞内的分布，它们之间存在相互作用并可能具有功能上的联系。在HEK293细胞内，可检测到内源性的PSMA3和Bim的复合物，尤其是凋亡信号刺激下的细胞。我们在实验中还发现，在HEK293亚细胞中显示PSMA3和Bim共定位、共表达，PSMA3可以一定程度上增加Bim表达而诱导的细胞凋亡。随着细胞凋亡机制的深入研究，人们对细胞凋亡机制的认识会更加深入。由于Bim的表达和调节具有细胞类型特异性，因而应用有效的诱导肿瘤细胞中Bim的表达水平上调可为肿瘤的治疗提供一个新的思路。

本研究初步发现，PSMA3对BIM介导的细胞凋亡具有一定的调节作用，这只是研究中的一点线索，PSMA3与Bim介导的细胞凋亡之间存在何种关系还需要进一步而大量的研究来探究。