妊娠期肝内胆汁淤积症与ABCB4基因外显子8突变的相关性研究

庞晓楠，李 慧，李铁臣

(皖南医学院 1.分子生物学研究室;2.机能学实验中心，安徽 芜湖 241002)

妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是妊娠期特有的对胎儿危害较大的肝内疾病，会导致胎儿早产或者死胎，其发病机制目前尚不清楚［1-2］。据相关文献报道ABCB4基因的突变可能与ICP的发生有一定的关系［1，3］。本实验采用PCR结合DNA序列测定的方法，通过分析15例ICP患者ABCB4基因外显子8(exon 8，E8)的突变情况，探讨其与ICP的发病是否存在相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料 纳入实验的ICP患者参照以下诊断标准:孕晚期出现皮肤瘙痒、黄疸等不适;血清胆酸或血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平显著增高;排除其他能引起瘙痒、黄疸和肝功能异常的疾病［4］。本实验的研究对象是2010年10月～2012年1月皖南医学院附属弋矶山医院的15例ICP住院患者。年龄23～30岁，平均(26.2±2.29)岁。所有入选病例均于产前抽取外周血2～3 ml，置于-20℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用常规酚-氯仿法抽提所收集的ICP患者外周血，制备成DNA标本于4℃条件下保存、备用。

1.2.2 聚合酶链反应(PCR)设计E8的上下游引物用于PCR扩增，引物序列在NCBI网站经BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)验证无误后，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

E8的上游引物序列为:5'-ATAGCCATCAGTAAAGGG-3'，下游引物序列为:5'-AAAGGGTTGACCAGAGTG-3'，产物大小 340 bp，退火温度65℃。PCR 总反应体积为 50 μl:模板 DNA 2 μl，Taq 酶2.5 U，10 × buffer(含 Mg2+)5 μl，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各 0.5 μl，加 ddH2O 至总体积 50 μl。

PCR试验过程在PTC-150型PCR仪(美国MJ公司产品)上完成，循环的具体过程为:98℃预变性5 min，94℃变性30 s，在此过程运行至20 s时加入Taq酶(Promega公司产品);65℃复性45 s，72℃延伸1 min，共33个循环，最后72℃延伸4 min。取10 μl PCR扩增产物加样，1.0%琼脂糖凝胶电泳30～60 min(电压 100V)，溴化乙锭(ethidium bromide，EB)染色，生物电泳图像分析系统(FR-200A)下观察结果，将所得PCR产物于4℃条件下保存。

1.2.3 DNA的测序 使用DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司产品)对PCR产物进行纯化回收。将纯化后的PCR产物以及E8的上游引物寄至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，返回的测序结果在NCBI网站进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)比对。

2 结果

2.1 PCR结果 15例ICP患者DNA标本的PCR扩增结果如下图所示，均扩增出目的片段，片段大小为340 bp(见图1)。

图1 ABCB4基因外显子8的PCR产物M:100 bp DNA Ladder Marker;1-11:ICP病例标本PCR产物Fig 1 PCR products of ABCB4 gene exon 8M:100 bp ladder DNA marker;1-11:PCR products of ICP patients

2.2 DNA序列测定结果 将15例ICP患者ABCB4基因外显子8的测序结果在NCBI网站进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)比对验证，结果发现其中有5例存在ABCB4基因外显子8的c.711A＞T杂合性突变(见图2、3)。

图2 ABCB4基因外显子8未发现突变测序图Fig 2 Sequence of ABCB4 gene exon 8 indicates absence of mutation

3 讨论

ICP的首发症状是瘙痒，一般主要发生在妊娠晚期，发生于中期和早期的频率依次降低;大约有30%的患者可以检测到γGT水平的升高;该疾病的主要风险是会导致早产、胎儿窘迫［5］。目前普遍认为ICP与性激素、遗传以及环境因素有关，具有明显的家族性、种族性和地域性，但其发病机制尚不明确［6］。

图3 ABCB4基因外显子8 c.711A＞T杂合性突变测序图Fig 3 Sequence of ABCB4 gene exon 8 indicates c.711A＞Theterozygous

ABCB4基因也称多药耐药基因3(multidrug resistance 3，MDR3)，位于染色体 7q21.1，基因全长约74 kb，共有27个外显子［3］。其编码的 P糖蛋白是一种ATP依赖性药物排出泵，属于ATP结合转运蛋白(ATP-binding cassette transporter)家族，该P糖蛋白输出的磷脂酰胆碱可以保护胆管免受胆汁盐的损伤［7］。若ABCB4基因突变导致编码的糖蛋白丢失或者功能丧失，则胆道内磷脂浓度的降低，缺乏磷脂的胆汁成分可能导致胆管受损、胆石沉积，诱发炎症并进一步导致各种肝脏疾病［8］。

1999年，Jacquemin等［9］首次证明了 ABCB4基因突变与ICP相关。国外的文献报道称ABCB4基因的突变热点主要涉及外显子 6、9、12、14、23［10］。本实验室曾对ABCB4基因的外显子6、12、14、23进行了研究，并未发现点突变［11-12］。刘玉凌等［13］采用PCR-SSCP的方法对30例中国ICP患者ABCB4基因的外显子6、9、12、14、23 进行研究，结果亦未见异常。综合以上研究报道，我们推测由于妊娠期肝内胆汁淤积症的发病存在地域和种族的差异，中国的ICP患者可能存在其他ABCB4基因的突变热点。Wasmuth等［14］认为ABCB4基因外显子8的c.711A＞T突变现象是瑞典人群中ICP重症患者发病的危险因素。为了探讨中国人群中ICP患者中是否存在外显子8的突变现象，本实验采用PCR和DNA序列测定的方法，对15例ICP患者ABCB4基因外显子8进行序列测定，发现其中5例存在c.711A＞T杂合性突变。这一发现提示，该位点的突变可能与中国人群中ICP的发病有一定的关联。

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