黄连素抑制肾腺癌细胞增殖及其分子机制

相 芳，相 红，朱月蓉，严 婷

(1.解放军第八一医院 药剂科，江苏 南京 210002;2.江苏省军区第一干休所 门诊部，江苏 南京 210037;3.解放军第八一医院 检验科，江苏 南京 210002;4.南京医科大学公共卫生学院 卫生分析检测中心，江苏 南京 210029)

黄连素(berberine)又称小檗碱，是从毛莨科黄连根状茎中提取的一种季胺类化合物，属于异喹啉生物碱。现已能够人工合成，具有抗菌谱较广、毒性和副作用较小等特点，主要用于肠道炎症。近年研究发现其有多方面的抗癌活性，其抗癌的机制主要有:抑制激活蛋白-1和尿激酶型纤溶酶原激活因子的活性;抑制环氧合酶-2活性;抑制N-乙酰化酶活性;阻滞细胞周期;抑制肿瘤生长促进剂的作用等。

黄连素在体外对宫颈癌Hela细胞具有生长抑制作用，并可诱导细胞凋亡，其诱导凋亡作用可能与Bcl-2蛋白表达下调有关［1］。黄连素可以增强自杀基因系统对直肠癌细胞的杀伤作用，可作为一种增效剂应用于直肠癌的治疗［2］。黄连素能够抑制非小细胞肺癌细胞 A549的迁移和黏附能力［3］。目前，黄连素在肾腺癌细胞发生和发展过程中的确切调控机制尚不清楚。肾腺癌的发生和恶化与肾腺癌细胞的增殖密切相关，我们推测黄连素可能通过抑制肾腺癌细胞的增殖而起到防治肾腺癌的作用。因此，本研究着重观察黄连素对人肾癌细胞ACHN增殖的影响，并探讨其分子机制，为揭示肾腺癌发病机制和可能的药物治疗方案提供新的细胞学证据。

1 材料和方法

1.1 材料 黄连素(Sigma，美国)，鼠抗 caspase 3单克隆抗体(南通碧云天，中国)，兔抗人c-Fos多克隆抗体(Abcam，美国)，鼠抗 β-actin单克隆抗体、lgG-HRP(上海康成，中国)，ECL发光试剂盒(Pierce，美国)。细胞培养箱(上海一恒，中国)，PCR仪(北京东胜，中国)，电泳仪、转膜仪和成像系统(北京六一，中国)，酶标仪(上海精密，中国)。

ACHN人肾腺癌细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，细胞培养使用添加10%(v/v)新生牛血清的DMEM高糖培养基，置于5%CO2、常氧(20%O2)、饱和湿度的37℃细胞培养箱中培养。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞增殖 将肾腺癌ACHN细胞铺至96孔板，每孔1×103个细胞。血清饥饿24 h后加入相应浓度的黄连素处理24或48 h，药物处理后各孔加入MTT(500 mg/L)100 μl，继续培养4 h。弃上清，加入二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)200 μl，摇床上轻轻振荡待甲臜沉淀完全溶解。酶标仪检测A490，利用A490数值代表存活细胞数绘制数值曲线。

1.2.2 蛋白提取和Western blot分析 RIPA蛋白裂解液裂解肾腺癌细胞后提取总蛋白，BCA比色法测定蛋白浓度。将蛋白煮沸5 min使其变性，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳条件为80 V电泳20～30 min，待溴酚蓝迁移出积层胶位置再换用100 V电泳90 min，电泳完毕后将蛋白经湿电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，抗β-actin抗体(1∶5 000)、抗 caspase 3抗体(1∶2 000)或抗 c-Fos抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜，TBST洗膜，lgG-HRP(1∶5 000)室温孵育2 h，TBST洗膜，暗室中加入ECL液孵育8 min后，利用凝胶电泳成像系统进行读片分析。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，计量结果采用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05表示有统计学差异。每组实验独立重复3次。

2 结果

2.1 黄连素抑制肾腺癌细胞的增殖 用MTT法检测黄连素处理后肾腺癌细胞增殖的变化，结果发现(表1)，10 μmol/L黄连素处理24 h后，代表细胞存活数量的A490值(0.485±0.014)显著低于未加黄连素组(0.622 ± 0.075)及5 μmol/L黄连素组(0.617 ±0.036);20 μmol/L 黄连素处理 24 h 后，A490值(0.401±0.019)也显著低于未加黄连素组及5 μmol/L黄连素组;10 μmol/L 黄连素处理 48 h后，A490 值(0.404 ±0.027)显著低于未加黄连素组(0.783 ± 0.0195)及 5 μmol/L 黄连素组(0.73 ±0.04);20 μmol/L 黄连素处理 48 h 后，A490 值(0.397±0.022)也显著低于未加黄连素组及5 μmol/L黄连素组。结果说明，低剂量(5 μmol/L)的黄连素不影响肾腺癌细胞增殖，较高剂量(10 μmol/L和20 μmol/L)的黄连素能够抑制肾腺癌细胞增殖。

表1 黄连素抑制肾腺癌细胞ACHN的增殖Tab 1 Berberine inhibiting the growth of ACHN cell line

2.2 黄连素不诱导肾腺癌细胞的凋亡 10 μmol/L黄连素处理肾腺癌细胞24 h和48 h后，用caspase 3抗体检测细胞的凋亡，Western blot结果未见明显的剪切后的 caspase 3(Cleaved-caspase 3)。结果说明，黄连素不诱导肾腺癌细胞的凋亡(图1)。

图1 黄连素不诱导肾腺癌细胞ACHN的凋亡Fig 1 Berberine failed to induce apoptosis of ACHN cell line

2.3 黄连素诱导肾腺癌细胞c-Fos表达下降 10 μmol/L黄连素处理肾腺癌细胞24 h后，用Western blot方法检测c-Fos的表达。结果显示，黄连素显著抑制了c-Fos的表达(图2)。该结果提示，黄连素抑制肾腺癌细胞的增殖可能通过下调c-Fos的表达来实现。

图2 黄连素诱导肾腺癌细胞c-Fos表达下降Fig 2 Berberine inhibiting the expression of c-Fos in ACHN cell line

3 讨论

黄连素作为抗菌药在临床上已应用多年，其疗效确切，是一种广谱抗菌药物，对多种格兰阳性和阴性菌以及真菌、霉菌、病毒、原虫、线虫具有抑制或杀灭作用。近年研究还表明，黄连素具有抗肿瘤作用，可诱导多种肿瘤细胞凋亡［4］。黄连素对人宫颈癌Hela细胞株的体外作用的研究发现，黄连素在体外对Hela细胞产生细胞毒作用并诱导其凋亡;免疫细胞化学法证实黄连素作用Hela细胞后Bcl-2蛋白表达下调，COX-2的表达无明显变化。由此说明，黄连素在体外对宫颈癌Hela细胞具有生长抑制作用，并可诱导细胞凋亡，其诱导凋亡作用可能与Bcl-2蛋白表达下调有关［5］。黄连素对甲状腺癌8505C和TPC1细胞株的体外作用的研究发现，黄连素有效的诱导甲状腺癌细胞的凋亡，而甲状腺癌细胞的凋亡可能是由于p-27表达上调引起的［6］。有人探讨黄连素联合腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因(Ad-CD)对直肠癌细胞的体外杀伤作用。结果发现黄连素可以增强自杀基因系统对直肠癌细胞的杀伤作用，可作为一种增效剂应用于直肠癌的治疗［7］。本研究发现，较高剂量(10～20 μmol/L)的黄连素在体外对肾癌细胞ACHN的增殖有明显的抑制作用，而低剂量(5 μmol/L)的黄连素不影响肾癌细胞ACHN的增殖。进一步研究发现，10 μmol/L黄连素并不诱导肾癌细胞ACHN的凋亡，只影响肾癌细胞的增殖。该结果和黄连素对甲状腺癌细胞的作用有不同之处［6］，说明黄连素对不同肿瘤增殖的抑制作用的机制不一致。

C-Fos基因是存在于人类、豚鼠和鸟类细胞核中的基因片段，这一因子可识别特定的DNA序列来启动细胞的增殖和分化。C-Fos可与c-Jun蛋白结合，引起多种原癌基因的转录，进而诱导肿瘤的发生和恶化［8］。Oya等发现，c-Fos和 c-Jun蛋白复合物参与肾癌细胞增殖的调控［9］。本研究发现，10 μmol/L黄连素处理肾癌细胞ACHN后，其c-Fos的表达量明显下调。本结果提示，黄连素抑制肾癌细胞ACHN的增殖可能是通过下调c-Fos的表达量来实现的，并验证了我们的假设，即黄连素可通过抑制肾腺癌细胞的增殖达到防治肾腺癌的目的。同时说明，c-Fos在肾癌增殖过程中可能起着十分重要的作用，但c-Fos在调控肾癌细胞增殖中的确切分子机制尚不清楚，需要进一步研究其下游靶标分子。

黄连素对肿瘤防治的作用，除了增殖外，可能还对迁移、黏附等起作用。史海岭等研究对黄连素作用后的肺腺癌A549细胞的增殖、迁移及黏附能力进行了检测，结果发现黄连素能够抑制A549细胞的迁移和黏附能力，其机制可能与下调MMP2和MMP9的mRNA表达，从而降低其活性有关［3］。黄连素对肿瘤防治的作用是多方面的，黄连素对防止肾癌恶化的作用可能不仅仅抑制其增殖。我们需要进一步研究黄连素对防止肾癌恶化的多重作用，以期找到全面防治肾癌发生和恶化的方法。

［1］狄晓鸿，高英敏，郭红云.黄连素对人宫颈癌Hela细胞株的体外作用研究［J］.中国中医药信息杂志，2008，15(1):31 －34.

［2］刘曾旭，余庆，马学强，等.腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因联合黄连素对直肠癌细胞的杀伤作用［J］.解剖学杂志，2009，32(5):635－638.

［3］史海岭，刘芬，郭晓军，等.黄连素对肺腺癌A549细胞增殖、迁移与黏附的影响［J］.中国癌症杂志，2009，19(12):910 －914.

［4］TAN W，LU J，HUANG M，et al.Anti-cancer natural products isolated from chinese medicinal herbs［J］.Chinese Medicine，2011，6:27.

［5］狄晓鸿，高英敏，郭红云.黄连素对人宫颈癌Hela细胞株的体外作用研究［J］.中国中医药信息杂志，2008，15(1):31 －33.

［6］PARK KS，KIM JB，BAE J，et al.Berberine inhibited the growth of thyroid cancer cell lines 8505C and TPC1［J］.Yonsei Med J，2012，53(2):346 －349.

［7］刘曾旭，余庆，马学强，等.腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因联合黄连素对直肠癌细胞的杀伤作用［J］.解剖学杂志，2009，32(5):635－638.

［8］WAGNER EF.Bone development and inflammatory disease is regulated by AP-1(Fos/Jun)［J］.Ann Rheum Dis，2010，Suppl 1:186－189.

［9］OYA M，MIKAMI S，MIZUNO R，et al.C-jun activation in acquired cystic kidney disease and renal cell carcinoma［J］.J Urol，2005，174(2):726 －730.