瓜蒌薤白正丁醇部位腺苷含量及特征图谱

鄢海燕，邹纯才，朱 磊，章圣朋，周文莉，王 洁

(皖南医学院 1.药剂学与生药学教研室;2.药物分析与药物化学教研室，安徽 芜湖 241002)

瓜蒌薤白颗粒是采用瓜蒌(由瓜蒌皮与瓜蒌仁按1∶1比例混合)、薤白两味药经提取有效成分制成的冲剂。瓜蒌开胸涤痰，可扩张冠状动脉，提高抗缺氧能力，还可抑制血小板聚集;薤白通阳宣痹，有舒张冠状动脉作用［1］。含氮类化合物是瓜蒌和薤白组方中的活性成分之一［2］，其中代表性成分腺苷的含量在一定程度上反映了瓜蒌薤白颗粒的质量，为此本实验采用高效液相色谱法测定瓜蒌薤白颗粒正丁醇部位腺苷的含量［3－7］并建立该部位的特征图谱，以其为评价和控制瓜蒌薤白颗粒的质量提供理论依据。

1 仪器与试药

岛津LC-20A高效液相色谱仪(含LC-20A真空在线脱气机，LC-20AT四元泵，CTO-10AS柱温箱，SPD-M20A检测器)，腺苷对照品(国药集团化学试剂有限公司，含量≥98.0%)甲醇、乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。10批瓜蒌薤白颗粒(自制)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取经五氧化二磷减压干燥12 h的腺苷对照品适量，加乙腈制得含腺苷100 mg/L的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取瓜蒌薤白颗粒2 g，加水15 ml溶解后，置于分液漏斗中，加入等量的水饱和正丁醇萃取三次，取正丁醇层，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。10批瓜蒌薤白颗粒原料来源见表1。

表1 瓜蒌薤白颗粒原料来源Tab 1 Sources the raw Gualou Xiebai granules

2.2 色谱条件 见文献［8］。

2.3 腺苷色谱峰的确认 瓜蒌薤白颗粒正丁醇提取物的色谱图，见图1。样品中7号峰为腺苷。验证方法见文献［8］。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 ml于 10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。按“2.2”项方法取各对照品溶液10 μl进样，以腺苷进样的质量(μg)作为横坐标X，峰面积积分值为纵坐标Y，绘制标准曲线并回归处理，结果表明，腺苷在0.10 ～2.00 μg范围内线性关系良好。回归方程为:Y=3 100 000X+2 433.5，相关系数 r=0.9998。

2.4.2 精密度试验 取对照品溶液重复进样5次(每次10 μl)，腺苷峰面积积分值的RSD为0.71%。

2.4.3 重复性试验 取同一批样品5份，精密称定，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，测定，计算腺苷百分含量，RSD为1.22%。

2.4.4 稳定性试验 精密量取同一供试品溶液，在24 h 内按0、6、12、18、24 h 间隔进样 5 次，供试品中腺苷峰面积积分值的RSD为1.03%。

2.4.5 回收率试验 精密称取2.0 g已知腺苷含量的样品6份，分别加入腺苷对照品适量，按“2.2”方法操作，依法测定，计算回收率，结果见表2。

表2 瓜蒌薤白颗粒样品中腺苷的加样回收率试验Tab 2 The average recovery rate of adenosine in Gualou Xiebai samples

2.5 样品含量测定 按上述方法，测定10批瓜蒌薤白颗粒样品，结果见表3。

表3 样品测定结果Tab 3 Testing results for the sample

2.6 瓜蒌薤白颗粒正丁醇部位HPLC特征图谱构建

2.6.1 特征图谱的测定 根据10批次供试品测定结果，瓜蒌薤白颗粒正丁醇部位高效液相色谱可分离出30多个色谱峰，以所有指纹图谱同一阈值置谱峰识别窗口(峰面积/所有峰面积的加和)≥0.005，得到共有峰的数目为10个。10批样品的特征图谱见图1。

图1 10批样品的特征图谱Fig 1 Characteristic spectrum for 10 batches of samples

上述指纹图谱中，以腺苷峰为参比峰，将其保留时间设置为1.00，标定了10个共有峰，共有峰(相对保留时间)的顺序如下:1(0.40)，2(0.43)，3(0.54)，4(0.65)，5(0.78)，6(0.91)，7(1.00)，8(1.17)，9(1.38)，10(1.73)。

2.6.2 指纹图谱相似度的计算 分别以10批样品指纹图谱共有峰峰面积的均值和中位数建立对照模板，如图2。利用相关系数法和夹角余弦法计算指纹图谱的相似度，2种方法计算的相似度结果见表4。

图2 共有模式图谱Fig 2 Spectrum of common pattern

表4 相似度计算结果Tab 4 Calculated similarity

3 讨论

本实验通过对梯度洗脱条件的不断改进，最终确定本实验的流动相梯度，并对正丁醇提取物中的腺苷进行了定量分析。该法准确，成分峰峰形良好，重复性较好，易于操作，因此可将此方法确定为瓜蒌薤白颗粒质量控制方法之一。

本实验对从药店和药材市场收集到的瓜蒌和薤白原料制备而成的瓜蒌薤白颗粒中的腺苷成分进行了含量测定。从表3中可以看到腺苷含量的最低为0.325%，最高为0.960%，说明不同产地的瓜蒌、薤白原料对产品内在质量有一定的影响。从图4可以直观地看出，10批样品的色谱峰不完全一致，峰面积或峰高也有较大差别。分别取均值和中位数建立对照模板，利用相关系数和夹角余弦对10批样品的全谱进行了相似度评价，从表4的结果中也反映出不同产地的瓜蒌、薤白原料对产品内在质量的影响很大，因此应强调中药材的规范化种植以确保患者用药的安全有效和疗效的重现性。

［1］孙志强，郑冀，代龙.瓜蒌薤白药理作用研究进展［J］.江西中医药，2010，41(11):76 －78.

［2］何祥久，邱峰，姚新生.瓜蒌薤白白酒汤活性成分研究Ⅳ:含氮及其它类化合物［J］.天然产物研究与开发，2003，15(1):9－11.

［3］吴晓民，王艳红，郑友兰.HPLC测定不同产地平贝母中腺苷的含量［J］.华西药学杂志，2006，21(1):74 －76.

［4］胡涛，马翠兰，林挺兴，等.高效液相色谱法测定龙眼果实腺苷含量［J］.福建农林大学学报(自然科学版)，2009，38(4):361－365.

［5］胡文璐，余俊，黄宗雯.反相HPLC法测定灵芝胶囊中腺苷的含量［J］.黑龙江医药，2009，22(5):599 －601.

［6］李宁宁，白冰，刘绣华，等.反相高效液相色谱法测定怀山药中腺苷的含量［J］.河南大学学报(自然科学版)，2009，39(5):485－487.

［7］韩静，丁永辉，宋平顺.HPLC法测定平贝母中腺苷的含量［J］.中国药师，2009，12(8):1070 －1071.

［8］鄢海燕，邹纯才.瓜蒌薤白颗粒的高效液相色谱特征图谱及与组方药味的相关性［J］.中国医院药学杂志，2013，33(4):25－28.