用异源蛋白和蛋壳体外培养鹌鹑胚胎的研究

张文昌，李玉芳，庄益芬*

(1. 福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002；2. 黄淮学院，河南 驻马店 463000)

转基因是禽类抗病育种和改善禽产品质量的快捷手段。而且禽类饲养成本低，繁殖能力高，转基因禽类可迅速扩群，禽蛋蛋白质含量高，表达的外源蛋白容易收集、保存、不易感染，作为生物反应器具有很大的优势。禽类转基因有很多途径，其中多数基因的转染、整合效率、表达水平低，只有病毒载体法[1]和显微注射法[2]比较成功地获得了转基因鸡。

禽类胚胎发育过程特殊，离开卵巢的卵母细胞在母体输卵管内受精并开始卵裂，排出体外时胚盘内已含有数以万计的细胞，此后在一定条件下，胚胎在体外蛋壳内发育成雏。禽蛋结构也独特复杂，卵黄大，卵子嵌在卵黄上，卵黄不透明，受精时多精入卵，形成多个雄原核，与雌原核融合的雄原核难以判断。可见禽胚体外培养技术对准确高效地实施卵子和早期胚胎转基因操作是至关重要的。同时禽类体外培养也是核移植、胚胎移植、体外受精以及胚胎冷冻等生物技术实施的重要环节。

禽胚体外培养技术的研究已有一百多年的历史，直到1984年Ono和Wakasugi 把正常孵化了2.5 d 的鹌鹑种蛋的除去壳以外的其他部分，原原本本地直接移入鸡蛋壳内培养，93例中有3例出雏[3]。1988年Perry综合前人研究的基础上，首次成功地将外部已包被了浓蛋白的鸡单细胞受精卵，保留浓蛋白，补充培养液，体外培养成鸡雏，实现了禽类完全体外培养的突破[4]。迄今为止，很少有人从事禽类胚胎脱离自然包裹在卵黄外部的蛋白，“裸黄”状态下培养的研究，而这种研究成果恰恰最便于进行禽类转基因等生物操作。我国鸡体外培养的研究还停留在以种蛋产出体外的胚胎为起点的水平上[5-8]，而鹌鹑体外培养尚无成功的报道。

鸡种蛋产出体外胚胎的培养都是以鸡的稀蛋白作为补充培养液的，鹌鹑蛋小，稀蛋白量少而粘稠，不宜提取。本试验拟探讨鹌鹑种蛋产出体外胚胎不经自然孵化，去除自然形成的蛋白，以易于提取的鸡的稀蛋白作培养液体外培养的方法，为禽胚胎操作提供方便。

1 材料与方法

1.1 器材及消毒用品

孵化器(QFC-552，江苏无锡东北塘孵化机场)，净化工作台(CJ-PT-102A，鸡西无线电专用设备厂)，简易天平，钢锯锯条，剃须刀片，保鲜膜，中间留有圆孔的方形薄木板，皮套，新洁尔灭，75%酒精。

1.2 种 蛋

采用中国白羽鹌鹑新鲜种蛋，在当地养殖户预定并购进100枚，从中选择50个胚胎进行培养。

1.3 培养液

用当地迪卡蛋鸡商品蛋中分离提取的稀蛋白。

1.4 代用蛋壳

实验过程中换壳2次，种蛋换壳培养2.5 d再行换壳。2次换壳所用代用蛋壳均来自当地鸡场刚刚开产的迪卡蛋鸡商品蛋。代用蛋壳用钢锯锯条和剃须刀片开口，口径约为2.0 cm。第1次换壳所用代用蛋壳去掉了鸡蛋的锐端，作壳蛋比种蛋重5 g以上，第2次换壳所用代用蛋壳在鸡蛋的钝端开口，作壳蛋比种蛋约重15 g。

1.5 禽蛋消毒

先用20 ℃左右的清水洗去种蛋、作壳和作培养液用蛋表面的污垢，再用同温的1%的新洁尔灭浸泡3 min，使用前用75%的酒精擦拭蛋壳。

1.6 换壳处理

换壳过程在净化工作台内进行。打开种蛋，剥离蛋白，把带有胚胎的裸黄小心地放入装有少量培养液的锐端开口的代用蛋壳内，再用同种培养液将蛋壳注满，开口用经灭菌的市售保鲜膜密封后，固定在中间留有圆孔的两块薄木板上，放入孵化器中培养。2.5 d后将内容物直接移入钝端开口的代用蛋壳中，培养液留量以与种蛋稀、浓蛋白总量相当为宜，开口仍用保鲜膜封好，膜与培养液间留出一定空间，作为人工气室，再放回孵化器培养至出雏。

1.7 胚胎培养

表1 鹌鹑胚胎培养条件Table 1 Conditions for the quail embryo culture

胚胎培养条件见表1。为保证鹌鹑胚胎正常呼吸，当鹌鹑胚胎啄壳，喙伸入气室时，在保鲜膜上钻一些小孔，待胎膜上血管枯萎时将封口保鲜膜揭掉，以培养皿取而代之，避免壳内水分快速增发。

1.8 繁殖能力测定

孵化出的雌雄鹌鹑同群饲养，产蛋阶段公母鹌鹑本交，鹌鹑蛋用于孵化，以测定用本方法孵化出鹌鹑的繁殖能力。

2 结 果

不同培养阶段鹌鹑胚胎的存活数和存活率见表2。2.5 d换壳时，50个处理胚珠周围都有血管出现，由于胚胎与代用蛋壳粘连，有4例卵黄破裂，换壳后不久又有3例停止了发育，15 d以后是胚胎死亡高峰阶段，夭折的25例胚胎都已成形，有些已经开始啄壳，但尿膜绒毛膜不完整，代用蛋壳锐端有少量蛋白残存，卵黄处于腹内、腹外各半的状态。孵化出的14只雏鹑有3只弱雏，其中1只跛行。育成4只公鹑和5只母鹑均有繁殖能力。

表2 不同培养阶段鹌鹑胚胎的存活数和存活率Table 2 The number and rate of surviving the quail embryos in different stage of culture

3 讨 论

3.1 异源蛋白对鹌鹑胚胎体外培养的影响

来自种蛋的鹌鹑胚胎处于裸黄状态，更便于胚胎操作，而培养裸黄上的胚胎，首先要解决培养液的问题。鸡种蛋产出体外阶段的胚胎直接裸黄培养成功的先例，是用鸡的稀蛋白作培养液的[5]，使用浓蛋白卵黄难于完全浸入，不利于胚胎与培养液充分接触，同时卵黄偏于一侧移动受阻，极易与蛋壳粘连。鹌鹑稀蛋白微乎其微，近于不能提取。本试验用与鹌鹑不同种禽类鸡的稀蛋白作鹌鹑胚胎培养液，出雏率达28%(14/50)，而且这些鹌鹑也已有了后代，没有出现排斥反应，也没有影响鹌鹑的繁殖能力，可见用鸡稀蛋白培养鹌鹑胚胎是可行的，这是禽类体外培养的一条新路。

3.2 代用蛋壳对鹌鹑胚胎体外培养的影响

本试验鹌鹑胚胎是在鸡蛋壳中培养成雏的，以往人们用鸡蛋或火鸡蛋做代用蛋壳培养鸡胚也获得了成功，表明禽类胚胎和同种[4-5]或不同种[9]禽类蛋壳之间可能不存在排斥反应。

3.3 胚胎死因分析

胚胎死亡出现两次高峰，第一次高峰出现在2.5 d换壳及随后较短的一段时间，7例中4例可能是由于卵黄没有了自然状态下系带的固定，在代用蛋壳中偏离正常位置，与蛋壳发生粘连而造成换壳时卵黄破裂。随即损失的3例可能与换壳的机械性刺激有关。第二次高峰出现在落盘后，从25例胚胎死亡的时间上分析，应该是多种因素持续作用累积的结果，在重新构建的鹌鹑胚胎培养体系中，鸡蛋壳的大小、形状及其矿物质的种类、含量和比例，鸡稀蛋白的成分，蛋壳内容物表面无内壳膜，两次换壳的机械性刺激，气室的大小，封口保鲜膜的通透性，翻蛋角度等都有别于正常孵化，这些因素都有可能潜移默化地对鹌鹑胚胎的正常发育产生着不同程度的影响，随着培养时间的推移，这些影响逐渐积累，最终在末期以大量胚胎死亡的形式表达出来。正常孵化条件下，翻蛋角度为90°，翻蛋有利于孵化初期卵黄囊的扩大和血管的分布，使卵黄迅速被胚胎利用而减轻，在孵化末期剩余的卵黄随着卵黄囊的收缩一同进入腹腔；翻蛋可促进尿囊绒毛膜的扩展，使形成的蛋白囊与卵黄囊和羊膜腔保持正常的相对位置，保证蛋白顺利地通过浆羊膜道进入羊膜腔而被胚胎利用；翻蛋还能防止胚胎和胎膜与壳膜粘连[10-11]。可见翻蛋不规范，一旦出现胎膜粘连，将导致卵黄不能进入腹腔、尿囊绒毛膜无法合围以及浆羊膜道阻塞蛋白吸收不完全。本试验为避免代用蛋壳开口对胎膜的损伤，2.5～14 d翻蛋角度设为50°，后期死亡胚胎尿囊绒毛膜不完整，代用蛋壳锐端有少量蛋白残存，卵黄未完全进入腹腔，表明在造成胚胎死亡的诸多因素中，翻蛋角度小是罪魁祸首。另外胚胎在超常规的人为环境下培养出现弱雏和畸形雏也不足为怪。

4 结 论

鹌鹑胚胎与鸡稀蛋白及蛋壳之间不存在排斥反应，用鸡稀蛋白和蛋壳培养鹌鹑胚胎是可行的。

参考文献:

[1] Bosselman R A, Hsu R Y, Boggs T, et al. Germ line transmission of exogenous genes in the chicken[J]. Science,1989,243: 533-535.

[2] Love J, Gribbin C, Mather C, et al. Transgenic birds by DNA microinjection[J]. Biotechnology (N Y), 1994, 12: 60-63.

[3] Ono T, Wakasugi N. Mineral content of quail embryos cultured in mineral-rich and mineral-free conditions[J]. Poultry science, 1984, 63: 159-166.

[4] Perry M M. A complete culture system for the chick embryo[J]. Nature, 1988, 331: 70-72.

[5] 张文昌. 鸡胚胎换蛋壳培养[J]. 中国家禽, 1991, 6: 31-32.

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[10] 王晓霞，杨佐君，何 欣，等. 家禽孵化手册[M]. 北京：中国农业大学出版社, 1999：11-22; 106-112.

[11] 高玉鹏. 现代孵化与育雏新技术[M]. 北京：中国农业出版社，2001：58-84.