乐至黑山羊与藏山羊HSC70、HSP70.1和HSF1基因的mRNA表达差异分析

牛惠然，字向东* ，任 陶，王 永，任称罗尔日，朱万岭，付锡三

(1.西南民族大学，青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，四川 成都 610041；2.四川省理县畜牧局，四川 理县 623100；3.四川省乐至县科技局，四川 乐至 641500)

正常细胞受到热刺激能引起热休克基因编码的热休克蛋白家族(HSP)的快速增殖和表达。不同的热休克蛋白家族成员依据其分子大小和在细胞中执行的功能进行分类。HSP90家族能与类固醇受体结合，发挥调节作用[1]，HSP70家族是蛋白质迁移和折叠的必需元件[2-3]，HSP60家族对于维持折叠后蛋白质的稳定性是非常重要的[4]。HSP家族已经被证实在鱼受到外界过冷、过热温度刺激时会出现表达上调，而这对于维持正常的免疫功能来说是至关重要的[5-6]。在已知的所有HSP家族中，HSP70作为感受压力的生物标记得到了较广泛的研究[7]。而诱导HSP70表达上调最主要的事件就是细胞遭到损害[8]。HSP70家族包括四类蛋白质：HSP73、HSP72、GRP75和GRP78。HSP73被称为HSP70同源蛋白(HSC70)，主要由组成型或称同源型的基因(HSC70)编码，HSP72属诱导性HSP70，HSP70.1是编码它的主要基因之一，这两个基因编码的HSP73和HSP72作为分子伴侣在细胞中起着关键性作用。当细胞暴露在各种极端压力环境中时，HSC70基因的表达量基本保持不变或者仅有轻微的上升，而HSP70.1基因却会被高度诱导表达。这一反应过程从低代谢表达水平时就开始启动，通过由HSF1基因编码的热休克转录因子(HSF1)的介导与转录控制元件结合为一个三聚体形式的HSP70的基因启动子来实现反应[9]。

乐至黑山羊经长期选育而成，具有前期生长发育快、产肉性能好、产羔率高等优点，主要分布在低海拔、夏季炎热的乐至县及其周边地区，是一种优良的地方山羊品种[10]。藏山羊以盛产山羊绒久负盛名，主要分布在高海拔、低温、缺氧的青藏高原，是当地牧民不可或缺的经济型家畜[11]。HSP70家族成员能依据机体组织所处环境进行调节，但是HSC70、HSP70.1以及HSF1等与抗性相关的热休克基因在哺乳动物中研究较少，本研究拟利用荧光定量PCR技术探讨HSC70、HSP70.1和HSF1基因在乐至黑山羊和藏山羊心脏、肝脏、卵巢、子宫、脑垂体等5个组织中的表达变化，以期筛选有用的生物标记及为实现应用标记辅助选择山羊的生态适应性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

试验动物为乐至黑山羊和藏山羊。在四川省乐至县天龙科技示范园随机选取6只3～5岁健康的舍饲成年乐至黑山羊母羊，当地海拔596 m，经纬度为30°30′N105°02′E。采样时间为8月中旬，此时日均温度31 ℃。在理县藏山羊养殖农户随机选取6只3～5岁健康的放牧藏山羊。海拔2 800 m左右，经纬度为31°43′N103°17′E。采样时间为9月中旬，日平均气温20℃。屠宰后，取其肝脏、心脏、卵巢、子宫、脑垂体等组织样，用生理盐水清洗后，迅速投入液氮中，带回实验室，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 总RNA的提取和cDNA的合成

从液氮中取出组织样，用高温处理过的剪子迅速剪下约20 mg组织，用天根公司的RNA提取试剂盒提取出乐至黑山羊和藏山羊的总RNA。

分别取6 μL mRNA溶液、1 μL Oligo (dT)18Primer、4 μL 5×Reaction Buffer、1 μL RiboLockTMRNase Inhibitor (20 U/μL)、2 μL 10mM dNTP Mix、1 μL RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase (200 U/μL) 混合，DEPC-treated water补足至20 μL后加入到200 μL RNase-free EP管中，混匀并离心；将该EP管置于PCR仪中，42 ℃恒温60 min，70 ℃ 5 min。反应结束后，即得cDNA， -20 ℃冰箱中保存，用于后续试验。

1.3 qPCR引物设计及特异性检测

根据GenBank中山羊HSC70、HSP70.1、HSF1和β-Actin序列，用Beacon Designer 7.0软件设计上述基因的定量上下游引物，送Invitrogen上海公司合成。引物序列及扩增产物长度见表1。

qPCR反应体系为10 μL：上下游引物各1 μL(2 μmol/L)，SsoFastTMEvaGreen Supermix 5 μL，ddH2O 2.5 μL，模板cDNA 0.5μL。

qPCR反应条件：反应在Bio-Rad CFX96实时定量PCR仪上进行，采用GCS八连管及盖子。95 ℃预变性3 min，95 ℃/10 s、58 ℃/20 s 45个循环。从65 ℃到95 ℃，每5 s升高0.5 ℃，收集荧光信号，绘制融解曲线，分析产物的特异性。为减小误差，每个样品设置三个重复，并设置三个无模板的空白管作为对照，以平均值参与数据分析。

表1 定量引物序列Table1 Primer pairs for qPCR

1.4 统计分析

qPCR所得数据利用2-△△CT方法计算后，再采用t-检验：双样本等方差假设分析HSC70、HSF1以及HSP70.1基因在乐至黑山羊和藏山羊各组织中的相对表达量倍比关系。

2 结 果

在本试验中通过对HSC70、HSF1和HSP70.1基因在乐至黑山羊和藏山羊5个组织中的mRNA表达量的分析，结果表明：HSC70 mRNA在藏山羊心脏中的表达量是乐至黑山羊的4.5倍，差异显著 (P<0.05)，在脑垂体中乐至黑山羊的表达量是藏山羊的3.7倍，差异显著(P<0.05)，而在卵巢、肝脏、子宫中两品种间无显著差异(图1)。HSF1 mRNA在藏山羊卵巢、心脏中的表达量分别是乐至黑山羊的7.9和3.1倍，差异显著(P<0.05)，但是在肝脏、子宫这两个组织样中却是乐至黑山羊表达量的高，分别为藏山羊的6.3倍和10.4倍(P<0.05;图2)。HSP70.1 mRNA在两种山羊的卵巢、肝脏、子宫和心脏中的表达量无显著差异，在脑垂体中乐至黑山羊是藏山羊的6.8倍，差异显著(P<0.05;图3)。

3 讨 论

图1HSC70基因在不同组织中的相对表达量(Mean±SE)
a.代表差异显著(P<0.05)。下同。
Fig. 1 Relative mRNA expression of HSC70 in five tissues
a.significant difference (P<0.05).The some below.

图2HSF1基因在不同组织中的相对表达量(Mean±SE)
Fig. 2 Relative mRNA expression of HSF1 in five tissues

图3 HSP70.1基因在不同组织中的相对表达量(Mean±SE)Fig. 3 Relative mRNA expression of HSP70.1 in five tissues

HSP是一类几乎在所有生物的细胞中遭受刺激后都能被高度诱导表达的蛋白质，它具有在极端条件下依旧维持自身机体正常运行的功能。其中，HSP70被认为是哺乳动物细胞HSP中最重要的，它主要与错误折叠的蛋白质相互作用，防止它们聚合在一起，发生细胞毒性反应[12-13]。Buckley等[14]在评价虾虎鱼的细胞对热应激的反应时，发现作为分子伴侣的HSP70是转录作用中较敏感的一类基因，它们具有组织特异性。本试验的研究结果也表明HSC70、HSF1和HSP70.1基因在乐至黑山羊或藏山羊的肝脏、子宫、脑垂体、心脏和卵巢等5个组织样中的表达不尽相同。

本研究中的乐至黑山羊采样于八月中旬，此时乐至县的日均气温达31 ℃，肝脏细胞持续处于高温造成的应激状态，对肝脏组织中的自由基代谢和抗氧化酶的影响较明显[15]。大量研究表明HSP70参与细胞的保护作用，以抵抗高温等造成的损伤，否则持续处于高温天气造成的热应激将会直接导致细胞的凋亡或坏死[16]。正常情况下HSP70处于基础表达水平，但处在高温这种有害应激状态下，细胞内变性蛋白水平会升高，HSP70通过与变性蛋白结合大量释放HSF1，HSF1再在磷酸激酶的作用下与热休克元件(HSE)结合，从而启动HSP70基因的转录使热休克蛋白大量表达来抑制应激，保护肝脏细胞[1,17]。图2显示，与HSP70表达相关的HSF1基因在乐至黑山羊中的表达量确实显著高于同期在日均温度为20 ℃理县饲养的藏山羊。

近年来，越来越多的研究还集中在HSP70对心脏等的保护机制中。Liu等[18]研究结果表明，HSP70可通过调节Ca2+通道内环境，对心肌起保护作用，使心脏在极端环境下仍能正常行使功能。HSP70也可通过保护心肌上的线粒体，使其保障心肌细胞正常的能量代谢，从而缓解心脏因缺血造成的再灌注损伤[19]。HSP70还能直接行使抗氧化作用保护心脏[20]。而HSP70的表达量直接受HSC70、HSF1和HSP70.1这三个基因相对表达量的影响。本研究中，乐至黑山羊是舍饲，而藏山羊是被放牧在高海拔、低氧、陡峭的山坡上，在这种环境下的放牧运动必然导致藏山羊心脏承受极大的压力。因此，藏山羊心脏中HSC70和HSF1基因的表达量显著高于乐至黑山羊，说明放牧的藏山羊通过调高心脏中HSC70和HSF1基因的表达量来维持其正常的生理功能，与以上理论相符。

本研究还发现在生殖轴乐至黑山羊垂体中HSC70 和HSP70.1基因的表达量以及子宫中HSF1基因的表达量都高于藏山羊，而藏山羊卵巢中HSF1基因的表达量显著高于乐至黑山羊，这种复杂的基因表达差异是否最终导致两个品种产羔率的差异有待进一步研究。

该研究结果初步揭示了HSC70、HSF1和HSP70.1基因在乐至黑山羊和藏山羊两个不同生态类型的山羊品种间的表达差异，这种差异可能与所处的生态环境和放牧运动有一定的关系。研究成果为深入研究山羊的生态适应性，以及选育抗逆山羊品种奠定了一定分子生物学基础。

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