醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的精确鉴定与药敏分析

聂璐，白银磊，李聪然，游雪甫

不动杆菌属（Acinetobacter spp.）是一类非发酵糖革兰阴性球杆菌，是近年来引起院内感染高发病率和死亡率的重要原因[1]。其中鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）临床分离率最高，可引起包括呼吸机相关性肺炎、皮肤和软组织感染、伤口感染、继发性脑膜炎、血行感染等各种感染[1-2]。氨基糖苷类及碳青霉烯类抗生素因其广谱、高效的特点，常用于临床治疗鲍曼不动杆菌感染[3-4]。但近年来，随着临床上广谱抗生素的大量使用，鲍曼不动杆菌呈现日益严峻的广泛耐药及多重耐药状况，受到各界关注[5-8]。基于此，药敏实验结果的准确性就显得尤为重要。

目前对于不动杆菌菌种的鉴定及药敏检测，临床多运用 VITEK 2等高效、便捷的自动化分析仪器进行，进而辅助临床给出适当的给药治疗方案。对于菌种的鉴定，这类自动化分析仪器主要依靠菌株表型的差异进行，但常引起院内感染的鲍曼不动杆菌在表型上与醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoacelicus）、菌种3（Acinetobacter genomic species 3）和13TU（Acinetobacter genomic species 13TU）十分相似，通过表型鉴定难以区分，因而将它们合称为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体（Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex）[9]。虽然各成员表型相近，但流行病学特征却有很大不同[10-11]。

菌种的精确鉴定及药敏的准确测定，以对鲍曼不动杆菌临床分布及耐药情况准确认识为前提。基于此，本研究在运用 VITEK 2 对不动杆菌临床分离株进行初步菌种鉴定的基础上，对难以区分的醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体菌株进一步进行 16S rRNA 序列分析，明确受试菌株的菌种类型。对确证的醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体菌株，运用VITEK 2 及微稀释法进行药敏实验，对药敏实验结果进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 受试菌株为实验室保藏的2006–2009年北京地区三甲医院收集的232 株不动杆菌。质控菌为大肠埃希菌（Escherichia coli）ATCC 25922、鲍曼不动杆菌 ATCC 19606。

1.1.2 主要试剂 Taq DNA 聚合酶购自美国Promega公司；引物由美国 Invitrogen 生物工程公司合成；VITEK 2 革兰阴性细菌鉴定卡、药敏试验卡 AST-GN13 购自法国梅里埃公司；MH 琼脂、营养肉汤培养基购自美国 Difco公司；阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、厄他培南、亚胺培南购自中国食品药品检定研究院。

1.1.3 主要仪器 VITEK 2 全自动细菌鉴定及药敏分析系统购自法国梅里埃公司；基因扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪购自美国 Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定

1.2.1.1 VITEK 2 试卡法 按仪器操作说明使用VITEK 2 革兰阴性细菌鉴定卡对收集的所有不动杆菌进行菌种鉴定。

1.2.1.2 16S rRNA 序列分析 对所有经 VITEK 2鉴定为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的菌株，运用聚合酶链式反应进行 16S rRNA 序列扩增测序[12]，并将测序结果在美国国家生物技术信息中心数据库（national center for biotechnology information，NCBI）中进行 BLAST 比对分析，确定醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体菌株所属准确种属。16S rRNA扩增引物为27F：5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'，519R：5' GTATTACCGCGGCTCCTG 3'，扩增条件为93 ℃ 预变性 3 min，然后以 93 ℃ 60 s、52 ℃ 35 s、72 ℃ 50 s 循环 35周期，最后1周期为72 ℃ 延伸 5 min。

1.2.2 药敏实验

1.2.2.1 VITEK 2 试卡法 按仪器操作说明，使用 VITEK 2 药敏试验卡 AST-GN13 对所有精确鉴定的醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体菌株进行药敏实验。

1.2.2.2 微稀释法 依据 CLSI 推荐药敏试验方法，采用 CAMH（cation-adjusted Mueller-Hinton broth）肉汤微稀释法进行药敏定量试验，测定抗生素阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、厄他培南、亚胺培南对所有精确鉴定的醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的MIC 值。抗生素测定浓度范围为0.03～1024μg/ml，细菌接种量为5×105cfu/ml。

1.2.2.3 药敏结果分析 依据 CLSI 推荐标准判断微稀释法药敏检测结果。VITEK 2 药敏结果与微稀释法结果进行比较，依据如下标准分类，并计算各类的百分率。标准符合率（categorical agreement，CA）：VITEK 2 药敏结果与微稀释法结果完全一致；严重错误（very major error，VME）：微稀释法结果为耐药（resistance，R），而 VITEK 2 药敏结果为敏感（susceptible，S）；重大错误（major error，ME）：微稀释法结果为S，而 VITEK 2 药敏结果为R；微小错误（minor error，MIE）：微稀释法结果为R 或 S，而 VITEK 2 药敏结果为中介（intermediate，I）或微稀释法结果为I，而 VITEK 2 药敏结果为R 或 S。

2 结果

2.1 菌株鉴定结果

232 株受试菌经 VITEK 2 鉴定，195 株（84.05%）为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体菌株。醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体菌株经 16S rRNA 序列扩增，获得特异性条带（图 1）。扩增产物经测序，并将测序结果在NCBI 数据库中进行 BLAST 比对分析（图 2），分析确证其中 173 株（88.72%）为鲍曼不动杆菌，22 株（11.28%）为醋酸钙不动杆菌，其他成员未检出。

图1 16S rRNA PCR 扩增片段Figure1 The 16S rRNA fragment by PCR

图2 16S rRNA 序列 BLAST 比对Figure2 16S rRNA sequence alignment

2.2 药敏实验结果

173 株鲍曼不动杆菌的药敏检测结果及误差分析见表1。从微稀释法测定结果看，受试鲍曼不动杆菌对三种氨基糖苷类抗生素（阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素）均呈现高水平耐药，MIC50值皆大于512μg/ml，其中阿米卡星活性稍强，而庆大霉素耐药程度最高；受试鲍曼不动杆菌对两种碳青霉烯类抗生素（亚胺培南和厄他培南）敏感度较高，亚胺培南和厄他培南的MIC50分别为1和4μg/ml。药敏误差分析显示，与微稀释法结果相比，各抗生素用 VITEK 2 试卡法进行的药敏检测结果存在不同程度的误差，厄他培南药敏结果符合率最低（仅为64.16%），出现重大错误的菌株占23.12%；阿米卡星药敏结果符合率稍高（65.90%），但出现严重错误的菌株高达 34.10%；而其余三种抗生素庆大霉素、妥布霉素和亚胺培南的VITEK 2药敏检测结果符合率较高（分别为87.28%、84.39%和95.38%），但妥布霉素的严重错误率也高达13.87%。

表1 173 株鲍曼不动杆菌对五种抗生素的MIC 值分析Table1 MICs and error rates obtained for 173 isolates of the Acinetobacter baumannii tested for susceptibility to three aminoglycosides and two carbapenems by VITEK 2

表2 22 株醋酸钙不动杆菌对五种抗生素的MIC 值分析Table2 MICs and error rates obtained for 22 isolates of the Acinetobacter calcoaceticus tested for susceptibility to three aminoglycosides and two carbapenems by VITEK 2

22株醋酸钙不动杆菌的药敏检测结果及误差分析见表2。从微稀释法测定药敏结果看，受试醋酸钙不动杆菌对三种氨基糖苷类抗生素（阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素）及两种碳青霉烯类抗生素（厄他培南和亚胺培南）均呈现较高敏感度，MIC50值分别为4、1、1、2和0.125μg/ml。其中碳青霉烯类抗生素活性稍强于氨基糖苷类抗生素。药敏误差分析显示，与微稀释法结果相比，VITEK 2试卡法进行的药敏检测结果中，厄他培南药敏结果符合率最低（仅为59.09%），出现重大错误的菌株高达 40.91%；妥布霉素的药敏结果符合率稍高（77.27%），出现严重错误的菌株占 18.18%；亚胺培南的药敏结果全部相符；其余两种抗生素阿米卡星和庆大霉素的药敏检测结果符合率较高，分别为90.91%和86.36%。

3 讨论

目前临床分离菌株的菌种鉴定主要依靠表型差异进行，VITEK 2等全自动分析仪凭借高效、便捷的优点成为临床常用的技术方法，但其只能鉴定不动杆菌属中有限的几个种，对生化特性相近的鲍曼不动杆菌、醋酸钙不动杆菌、菌种3和13TU 则难以区分。鲍曼不动杆菌、醋酸钙不动杆菌、菌种3和13TU 虽然表型相似，但流行病学特征却大相径庭，醋酸钙不动杆菌主要存在于环境样本，菌种3 主要存在于皮肤表面和环境样本，菌种13TU 主要存在于临床样本，而鲍曼不动杆菌则为院内感染的主要病原体之一[10-11]。菌种鉴定不精确的缺陷，导致目前很多有关鲍曼不动杆菌的耐药及流行病学资料存在误差，严重影响了对鲍曼不动杆菌耐药现状及临床分布状况的认知。

本研究结合 16S rRNA 序列分析进一步确证，经 VITEK 2 鉴定为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的195 株菌株中，88.72% 为鲍曼不动杆菌，11.28% 为醋酸钙不动杆菌。

耐药率高低与临床治疗用药策略的选择直接相关。多年来由于庆大霉素敏感率低，临床已逐渐弃用，而代之以阿米卡星的广泛使用，尤其针对产ESBLs的革兰阴性杆菌，临床仍主张首选碳青霉烯类与阿米卡星联合使用。伴随着治疗策略的改变，临床分离菌株对阿米卡星耐药率也逐年升高，且一旦耐药即呈现为高水平耐药的趋势。我们研究发现，2006–2009年收集的173 株北京地区临床分离鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素的耐药情况严重，阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素的敏感率分别仅为41.04%、30.64%和38.15%，三者的MIC50值皆大于512μg/ml；22 株醋酸钙不动杆菌对这两类抗生素整体都表现出较高的敏感度，尤其是对碳青霉烯类呈现出100% 敏感，对厄他培南及亚胺培南的MIC50值分别为2μg/ml和0.125μg/ml。

微稀释法可确定被检菌对某抗菌药物的MIC，是 CLSI 推荐的药敏定量试验，可作为其他药敏定量试验方法的评价标准。因微稀释法操作繁琐、工作量大，在临床大标本量的药敏实验中未被推广使用。VITEK 2等全自动分析仪却很好地弥补了这类缺陷，广泛应用于临床药敏检测中。氨基糖苷类和碳青霉烯类抗生素是临床上治疗鲍曼不动杆菌感染的常用药物，临床往往根据 VITEK 2等全自动分析仪所得的药敏检测结果制定相应治疗方案，因此其药敏检测结果的准确性对临床治疗至关重要。

在本研究中，通过与微稀释法药敏检测结果相比，显示 VITEK 2 在药敏检测中存在局限性，某些药物的药敏检测结果准确度低，可能造成临床治疗方案的不合理。研究结果显示，与微稀释法药敏检测结果相比，鲍曼不动杆菌经 VITEK 2 测得的五种抗生素的药敏检测结果均存在不同程度的误差。其中阿米卡星尤为严重，药敏结果符合率仅为65.90%，严重错误率高达 34.10%。这使临床对很多阿米卡星耐药的鲍曼不动杆菌做出敏感判断，导致不合理用药方案的制定，从而延误治疗，并可能因不合理用药导致菌株耐药情况的加重。妥布霉素药敏结果符合率达 84.39%，但其严重错误占13.87%。庆大霉素药敏符合率较高，为87.28%，但也存在严重错误和微小错误。本研究中氨基糖苷类抗生素药敏检测误差分析结果与Akers等[13]研究结果相符。厄他培南药敏结果不符合率稍高于阿米卡星，重大错误率为23.12%，这使临床对部分厄他培南敏感的鲍曼不动杆菌菌株做出耐药判断，很可能使治疗方法中可选药物减少，使临床患者得不到及时有效治疗。亚胺培南药敏结果符合率最高，达 95.38%，但也存在严重错误和微小错误。本研究中碳青霉烯类抗生素药敏检测误差分析结果与Markelz等[14]研究结果相符。受试菌中的鲍曼不动杆菌对这两种碳青霉烯类抗生素均呈现较高敏感度，且亚胺培南活性更强。

醋酸钙不动杆菌经 VITEK 2 测定所得的五种抗生素的药敏检测结果，除厄他培南药敏结果符合率较低外，其余药敏结果符合率都在80% 左右，亚胺培南的药敏结果符合率更是达到了 100%。厄他培南药敏结果符合率最低，仅为59.09%，出现重大错误率为40.91%；妥布霉素的药敏结果出现较多严重大错误，严重错误率为18.18%。这都可能造成临床上不合理治疗方案的出现。

16S rRNA 序列分析是一种简单、可靠、重复性高的菌种鉴定方法，鉴于VITEK 2 在不动杆菌菌种鉴定中的局限性，可辅以 16S rRNA 序列分析，精确鉴定醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体；鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素呈现高水平耐药，醋酸钙不动杆菌对碳青霉烯类抗生素呈现高水平敏感；VITEK 2 测定鲍曼不动杆菌对阿米卡星药敏结果符合率低，严重错误率高，测定醋酸钙不动杆菌对厄他培南药敏结果的符合率低，重大错误率高，建议辅以微稀释法。

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