兔出血症病毒ZB株的分离与鉴定

杨丽梅, 马 力,王艳萍, 沈志强*, 李 峰, 郭时金, 张 颖, 张志美, 徐倩倩

(1. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州256600；2. 山东绿都安特动物药业有限公司，山东 滨州256600)

兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一种烈性、急性、毁灭性、高度接触性传染病[1-2]，该病于1984年在我国江苏地区爆发[3]，现已呈全球性流行[4-6]，该病以呼吸系统和肝脏、脾脏、肾脏、心脏等实质脏器淤血、出血和肿大为主要病变特征，以传播快速、高发病率和高死亡率为主要流行特征[1,3,6]，给全球养兔业造成了极大危害，带来了巨大的经济损失，国际动物卫生组织将该病列为B类动物传染病，我国农业部兽医局也将其列为二类动物疫病[7]。RHDV属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)，为正链、单股RNA病毒，编码VP10和VP60 2个蛋白，其中VP60为病毒的结构蛋白、免疫原性蛋白、具有高度保守性，是RHD新型疫苗、诊断制品、分子流行病学调查的首选基因[8-10]。Alda等[11]将VP60基因进行了克隆和系统发育进化分析，指出不同地区RHDV的分子特征与进化史，丰富了RHDV分子流行病学调查资料。管夕柱等[12]对青岛即墨地区的分离病毒株VP60结构蛋白的全基因序列进行了qPCR 扩增、测序和比对分析，指出该毒株VP60基因长度与其他已知毒株一致，与已发表RHDV毒株的VP60基因的同源性均在90%以上，在系统进化上与俄罗斯2009年的一个流行毒株同源性最高达98.1%。本研究成功分离鉴定了一株RHDV ZB株，丰富了我国RHDV地方毒株资源，为我国RHDV的分子流行病学调查与相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、血清与试验动物

克隆菌株DH5α感受态细胞由山东省滨州兽医生物技术重点实验室制备并保存；兔病毒性出血症阳性血清由山东绿都生物科技有限公司提供；未免疫过兔病毒性出血症病毒任何疫苗的健康易感兔购自滨州市华龙养兔场。

1.2 主要试剂

0.22 μm微孔滤膜购自上海半岛实业有限公司净化器材厂；RNA抽提试剂盒购自研域(上海)化学试剂有限公司；One step RT-PCR kit(一步法反转录PCR试剂盒)购自上海索莱宝生物科技有限公司；pMD18-T克隆载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 临床诊断与病料的采集

调查发病兔场的流行病学，观察发病兔的临床症状，解剖并观察病死兔的病理变化。采集病死兔肝脏、脾脏等具有典型病例变化的病变组织，放入自封袋内，低温运输。

1.4 病毒的分离

将采集的病料组织与灭菌生理盐水(质量体积比约为1∶4)于灭菌研钵充分研磨，反复冻融三次后，于4 ℃ 10 000 r/min 离心10 min，将上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液经颈部皮下注射2月龄健康易感兔4只，每只2 mL，同时设立对照组4只兔，注射灭菌生理盐水作为对照，隔离饲养，观察7 d。观察病死兔的症状和病理变化，无菌取死亡兔的肝脏组织按上述1.3的方法处理后，盲传3代。

1.5 纯净性检测

按《中华人民共和国兽药典》[13]附录中的检验方法进行细菌、霉菌、支原体的检测。

1.6 血凝效价测定

取第3代分离病毒，按常规方法测定其对人“O”型红细胞的凝集效价。

1.7 致病性试验

将第3代分离病毒作104倍稀释接种2月龄健康易感兔4只，每只1 mL，同时设立对照组4只兔，注射灭菌生理盐水作为对照，隔离饲养，观察7 d。观察试验兔的症状和病理变化。

1.8 特异性试验

将第3代分离病毒用灭菌生理盐水稀释为4个血凝单位的病毒悬液，与等量的抗兔病毒性出血症病毒特异性血清混匀后，37 ℃作用30 min进行中和。中和完毕后，测定其对人“O”型红细胞的凝集性，同时设立阳性对照组和阴性对照组。

1.9 免疫原性试验

将第3代分离病毒经甲醛灭活后，注射2月龄健康易感兔4只，每只1 mL，同时设立对照组4只兔。14 d后，二组兔同时注射10倍稀释的第3代分离病毒，观察7 d，记录试验兔的症状和病理变化。

1.10 qPCR与序列鉴定

1.10.1 引物设计与合成 根据文献[14]的方法，在VP60基因外部设计RHDV VP60的1对特异性引物：上游引物F：5'-AGTTACGATGCTGCTAGAAAG-3'，下游引物R：5'-GCAAGTCCCAA TCCGATGAAT-3'，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.10.2 RNA提取 取第3代分离病毒200 μL，按RNA抽提试剂盒使用说明提取病毒基因组RNA。

1.10.3 VP60基因qPCR扩增 以提取的第3代分离病毒基因组RNA为模板，参照文献[14]中的方法进行qPCR扩增反应。取5 μL qPCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。

1.10.4 分离病毒VP60基因的克隆与序列测定 将大小正确的VP60基因RT-PCR扩增产物用胶回收试剂盒纯化回收后，连接至pMD18-T克隆载体，转化DH5α感受态细胞，提取质粒DNA，用EcoR I/Hind III双酶切鉴定，鉴定正确的阳性质粒命名为pMD-VP60，将其送测序公司进行序列测定。

2 结 果

2.1 临床诊断结果

该发病兔场临床表现为成年兔首先发病，发病率在90 %左右。病兔主要表现为食欲急剧下降，同时精神沉郁，体温急剧升高(均在41 ℃以上)；兔发病后3 d开始出现死亡，病兔死亡前瘫软、不能站立，但高声尖叫、挣扎、撞击笼架，部分病兔鼻孔岀血，死后呈角弓反张。病兔剖检后可见各脏器都有不同程度的淤血、出血和充血，其中肝脏最为明显，且肝脏异常肿大；喉头、气管粘膜淤血或弥漫性出血，以气管环最为明显，整个气管粘膜呈弥漫性暗红色。根据以上主要症状初步诊断为由兔病毒性出血症病毒感染所致，无菌采集病死兔肝脏、脾脏等具有典型病例变化的病变组织。

2.2 病毒分离

接种病料组织的4只健康家兔均在48～96 h内发病且死亡，发病兔体温高达41 ℃，精神委顿，表现出尖叫、挣扎等神经症状。病死兔剖检发现死兔肾脏、脾脏、肝脏、等全身实质器官淤血、出血、充血，气管岀血。对照组4只兔没有表现任何症状和不良反应，全部健康。无菌条件下，采集病死兔肝脏，将其命名为ZB株，继续传3代后，-20 ℃保存。

2.3 病毒纯净性的检测结果

按现行兽药典的检验方法对分离病毒进行了细菌、霉菌、支原体的检测，结果分离病毒无细菌、霉菌、支原体生长。

2.4 病毒血凝效价的测定结果

按常规的血凝试验方法测定ZB株第3代病毒对人“O”型红细泡的凝集效价为1∶1024。

2.5 致病性试验结果

接种104倍稀释的ZB株第3代分离病毒的4只兔在96 h内全部死亡，攻毒兔表现出典型的兔病毒性出血症病毒临床症状和病例变化。对照组4只兔没有表现任何症状和不良反应，全部健康。

2.6 特异性试验结果

除阳性对照组能够凝集人“O”型红细胞外，分离病毒-阳性血清中和组、阴性对照组均不能凝集人“O”型红细胞，表明兔病毒性出血症阳性血清能够特异性中和ZB株第3代分离病毒。

2.7 免疫原性试验结果

功毒后，免疫由ZB株第3代分离病毒制备的兔病毒性出血症灭活疫苗的4只兔全部健活，对照组4只兔全死亡于兔病毒性出血症病毒，表明兔病毒性出血症ZB株分离病毒具有良好的免疫原性。

2.8 分离病毒qPCR扩增结果

如图1所示，ZB株第3代分离病毒RT-PCR扩增产物在位于约1 842 bp处可见明显的特异性DNA扩增条带，与文献[14]报道完全一致。

2.9 VP60基因的克隆与测序鉴定

如图2所示，构建的pMD-VP60克隆质粒经EcoR I/Hind III双酶切鉴定得到了约2 700 bp片段(pMD18-T载体)和1 842 bp片段(VP60基因)，扩增片段经测序鉴定确定为RHDV VP60基因。

图1 RT-PCR扩增结果Fig.1 Result of PCR amplificationM.DNA标准DL 2000; 1.第3代病毒的RT-PCR 扩增产物; 2.对照M.DNA Marker DL 2000; 1.Product of RT-PCR;2.Control

图2 重组质粒pMD-VP60酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant cloning vectorM.DNA标准DL 2000;1.重组质粒pMD-VP60 EcoR I/Hind III酶切;2.对照M.DNA Marker DL 2000;1.Recombinant plasmid digestedby EcoR I/Hind III；2.Control

3 讨 论

兔病毒性出血症是目前危害养兔业最为严重的急性、烈性传染病，发病率和死亡率都极高，兔场一旦有兔感染该病毒，就会在整个养殖场内迅速暴发，给兔群带来毁灭性的灾难，造成十分巨大的经济损失，严重阻碍了我国养兔业的健康发展。因此，做好兔病毒性出血症病毒的诊断与防治对保障养殖业、增加国民收人均具有十分重要的现实意义。本研究对山东淄博高青地区某养殖场出现的家兔急性死亡进行了诊断，根据病兔的临床症状和剖检特征初步诊断为由兔病毒性出血症病毒感染所致。为进一步确诊，本研究进行了病毒分离、纯净性检测、血凝性检测、致病性试验、特异性试验、免疫原性试验以及VP60基因扩增片段的序列鉴定。将采集的肝脏等病料组织接种健康家兔后成功分离出一株兔病毒性出血症病毒，将其命名为ZB株，该分离株病毒不含细菌、霉菌、支原体，具有良好的纯净性；该分离株病毒对人“O”型红细泡的血凝效价为1∶1024，具有较高的病毒含量；104倍稀释的该分离株病毒能够使健康易感兔在96 h内全部死亡于兔病毒性出血症病毒，具有高度的致病性与较高的毒力；该分离株病毒与兔病毒性出血症病毒特异性阳性血清中和后不能凝集人“O”型红细胞，具有良好的特异性；免疫由该分离株病毒制备的灭活疫苗的健康兔攻毒后全部健活，表明该分离株病毒具有良好的免疫原性；RNA病毒的结构基因受环境选择压力的作用最易发生变异[10]，本研究对RHDV唯一的结构蛋白(VP60基因)进行了克隆与测序，证明分离株纯净性好、病毒含量高、毒力强、免疫原性好、为ZB株兔病毒性出血症病毒，为兔病毒性出血症优质疫苗的成功研发奠定了良好的基础，同时为兔场的发病确定了病原，丰富了我国RHDV地方分离毒株资源，为RHDV分子流行病学调查提供了参考。

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