MicroRNA对皮肤毛囊发育调控的研究进展

张桂山，徐 晶,姜怀志*

(1. 吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学 发展学院，吉林 长春 130600)

皮肤是保护身体内部器官免受外界环境危害以及保持体内水分的重要屏障。在真皮乳头层里，毛根被内、外毛鞘包围，外毛鞘又被结缔组织细胞包围，形成口袋状，称毛囊(hair follicle)。毛囊由毛杆，毛凸，毛球，毛乳头，毛基质等部分组成。毛囊分为初级毛囊和次级毛囊。毛囊发育包含三个时期，分别是生长期(anagen)、退行期(catagen)及休止期(telogen)。miRNA是一类由19～25个核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA，通过与靶基因mRNA3’端非编码区配对结合，并根据互补程度不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。据估计有超过三分之一的编码蛋白受到miRNA的调节。目前关于miRNA的研究主要集中于人和小鼠，而miRNA对羊等家畜皮肤毛囊发育的分子调控机制研究报道的文献相对较少。

1 miRNA的生源说及功能

miRNA是一类含19-25 nt的RNA分子，是大量细胞进程的必需调节器。通过促进mRNA降解或抑制mRNA翻译从而调节基因表达，对于哺乳动物主要是通过对mRNA翻译的抑制，来调节基因的表达[1]。据估计超过三分之一的编码蛋白mRNA受到miRNA的调节。miRNA的表达有3种不同的转录调节机制。基因内位于内含子区miRNA被转录前体编码，并与编码基因转录共用同一个启动子，需要II型RNA聚合酶和剪接体元件来完成生物发生；基因间的miRNA 位于非编码区，由未知启动子转录[2]；多顺反子的miRNA来源于含有多个发夹结构的原始转录本，不同的发夹结构生成不同的miRNA。miRNA的生源说是复杂的，在哺乳动物细胞内，与蛋白编码基因类似，miRNA的转录需要RNA 聚合酶II参与。pri-miRNA转录本通常由几千个碱基对构成，在3’末端加尾，5’端加一个7-甲基鸟苷的帽子，但成熟的miRNA5’端没有帽子结构，3’端没有尾巴结构[3]。细胞核内的核糖核酸酶ⅢDrosha分解pri-miRNA为几个miRNA前体(premiRNA)，辅助因子DGCR8是Drosha活性所必需，它的两个双链RNA结合域首先与pri-miRNA相结合，Drosha与辅助因子DGCR8复合物在pri-miRNA底部ssRNA/dsRNA 结合点将pri-miRNA切割。miRNA前体大约70-90 nt，是带有茎环发夹结构的二级结构[4-5]，miRNA前体3’端包含2 nt的突出端[6-7]。核输出蛋白5属于核周蛋白家族核质转运因子，负责运输病毒的发夹RNA和一些tRNA。一旦miRNA前体被运输进入细胞质，被叫做Dicer(切酶)的核糖核酸酶Ⅲ在几个辅助因子(TAR RNA结合蛋白，TRBP与 PACT)的作用下对miRNA前体进行加工，形成带有2 nt突出端的21-27 nt的片段，Dicer最终将其加工成为成熟的miRNA，进而形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)[8]。Thomas Andl[9]发现Dicer在miRNA调控小鼠表皮、毛囊发育及功能具有重要作用。miRNA通过和靶基因mRNA碱基互补配对引导沉默复合体(RISC)降解靶mRNA或阻碍其翻译，根据碱基互补程度或使靶mRNA降解，或抑制其翻译，进而调节基因表达[10]。如果miRNA与靶mRNA完全互补，沉默复合体则使靶mRNA降解，部分互补则使靶mRNA脱帽或脱腺苷化抑制其翻译[11]。最近的研究表明miRNA参与多种调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、免疫应答等等。miRNA 生源说及转录后基因沉默机制如图1[11]所示：

图1 miRNA 生源说及转录后基因沉默机制[11]Fig.1 miRNA biogenesis and post-transcriptional gene silencing mechanism

2 miRNA在皮肤中表达的检测技术

了解miRNA的调节功能，首先要正确认识miRNA。关于miRNA的早期研究是基于小RNA及cDNA的克隆测序技术来发现新的miRNA。将19-30 nt的小片段RNA 3’端和5’端结扎，形成特定的包含3’端和5’端具Dicer分裂产物特性的单链RNA，此过程需要RNA酶III的作用。对已克隆的小RNA库进行PCR扩增测序，进而测定小RNA的序列和表达丰度，Yi等[12]将此法应用于17.5 d 胎鼠表皮与毛囊miRNA克隆测序发现，miR-199家族在毛囊中高表达，而在表皮中无表达；而miR-200家族则都表达，说明miRNA呈现组织特异性表达。此外，let-7家族、miR-21和 miR-17家族以及miRNA的一个亚型miR-203在上皮组织中表达。随着技术的进步，微阵列(芯片)技术被用于快速检测上皮组织中miRNA。随着对miRNA在皮肤组织中表达的深入研究，研究者由基于微阵列技术转向研究情境变化后miRNA在信号通路中的表达。Ryan等[9,13]对Dkk1过表达的转基因鼠研究发现，miR-200b 和 miR-196a在毛囊发育过程中具有重要作用。为了阐明单个miRNA时空表达，研究人员采用原位杂交技术详尽的阐述了miR-203在哺乳动物皮肤中的表达[14]。Yi[15]采用深度测序技术用于检测表皮miRNA的表达。唐晓惠[16]采用高通量的深度测序技术在藏绵羊皮肤毛囊内发现了86个全新的miRNA。深度测序技术发现或寻找新的miRNA的能力得到了极大的提高[15]。此外，实时荧光定量RT-PCR，Northern blot等方法可以用于miRNA表达量的检测。

3 miRNA对皮肤毛囊发育的调控

大多数 miRNA呈现出组织特异性表达以及不同发育阶段特异性表达的特点，这说明miRNA可能参与了复杂的基因表达调控过程，并决定了生物发生发育功能。miRNA参与多种动物表皮形态学发生及毛囊的生长发育过程。Yi等[12]研究发现表皮和毛囊内miRNA的表达是小鼠正常皮肤发育所必需。p63是复层上皮组织中维持干细胞的必需调节器，而miR-203直接抑制p63的表达，miR-203明确了基底粗细胞和分化的上基部细胞的分子调节范围，从而确保临近皮层的固有的功能[17]。赫晓燕[18]研究了羊驼耳部和背部皮肤组织中miRNA 差异表达，通过miRNA芯片检测到39个miRNA在耳部和背部皮肤高表达，利用预测软件预测发现let-7b 和miR-24 的靶基因中含有与毛囊生长发育和毛发品质相关的基因，说明miRNA 可能参与羊驼皮肤和毛囊的生长发育、更新以及毛发品质的调控。唐晓惠[16]采用Solexa高通量测序从藏绵羊皮肤毛囊中发现了86个全新的miRNA。三个时期毛囊特异表达miRNA的数量分别为：生长期10个，衰退期27个，休止期7个。通过实时定量基因扩增荧光检测系统检测发现miRNA-31在绵羊毛囊的生长发育中存在差异表达，其中在生长期高表达，而在衰退期低表达，呈逐渐下降的趋势，同时预测了 miRNA-31的靶基因，发现KRT17与miRNA-31存在潜在的靶位点；此外研究还发现miRNA-184的表达量从毛囊生长期到衰退期呈逐步上升的趋势，而miRNA-205则表现为先上升后下降，其在衰退期毛囊表达量最高。Zhang等[19]采用高通量测序技术对鸭皮肤毛囊miRNA进行了序型分析，采用生物信息学分析预测miRNA的靶基因，并发现miRNA在鸭皮肤功能和皮肤演化过程中具有重要作用[19]。Wnt/β-catenin、Shh-Bmp及Notch信号通路在皮肤毛囊发育过程中具有重要作用，通过生物信息学预测，miR-1623的靶基因β-catenin是Wnt/β-catenin通路中的关键分子，这也说明了miR-1623在皮肤毛囊发育过程中的重要调控作用。miR-107和 miR-10a表达上调，而miR-17-3p，miR-31，miR-451，miR-2188，miR-1623表达下调。Mardaryev[20]研究发现小鼠毛囊miR-31表达量从退行期到休止期显著增加，将反义miR-31抑制因子注入小鼠皮肤内，结果加速了毛囊生长期发育，改变了毛基质角质细胞的分化和毛干的形成。微阵列、qRT-PCR 和 Western blot分析miR-31负调节Fgf，Dlx3转录因子及Wnt/Bmp信号通路元件等的表达，荧光指针测定miR-31的靶基因包括Krt16， Krt17， Dlx3及Fgf10，说明miR-31通过调节毛囊中靶基因的表达，从而保证毛囊发育及毛纤维的生成[20]。Corey[21]研究发现miR181a在培养的雏鸡耳蜗基底乳头中过表达，并促进新毛细胞增殖，通过anti-miR181a转染，进一步验证miR181a在雏鸡内耳毛细胞再生中的重要作用，发现anti-miR181a显著钝化细胞再生应答，这就说明了miR181a促细胞增殖的作用。

4 展 望

羊毛的品质与产量是影响羊毛生产的最重要经济因素。毛囊数量及毛囊的形态决定着毛(绒)产量及品质。毛囊发生及毛(绒)生长周期分子调控机制具有一定的保守性，但不同物种和不同品种动物的毛囊具有物种和品种特异性，小鼠和人的毛囊研究结果并不能完全适用于羊等其它动物。由于miRNA广泛参与组织细胞等发生发育调控，miRNA给我们提供了一个新的研究羊皮肤毛囊发育调控思路。通过miRNA表达及靶基因、靶蛋白的预测，进而应用转录组学、蛋白质组学等方法揭示羊皮肤毛囊发育及生长周期的分子调控机制，筛选出控制毛(绒)生长性状及品质性状的重要基因及其它调控因子，进一步采用活体试验与离体试验验证相关调控因子的功能，从而明确皮肤毛囊发育的分子调控机制，为羊育种提供理论依据。

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