黑番鸭VIPR-1基因第12内含子SNP与就巢性状关联分析

辛清武，缪中纬，郑嫩珠，朱志明，黄勤楼

(福建省农业科学院 畜牧兽医研究所，福建 福州 350013)

产蛋量是家禽的一个极为重要的数量性状，属于限制性状和低遗传力性状。黑番鸭年产蛋量较低，仅90枚左右，其较强的就巢性是繁殖力较低的主要原因。由于家禽就巢性状的遗传力较低，国内外众多家禽研究者将目光集中在与生殖内分泌相关的基因上，以期阐明家禽的就巢机制，降低或阻止家禽就巢来提高繁殖力。

催乳素(prolactin，PRL) 被认为是引起家禽就巢行为发生和维持的关键因素，而血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是公认的PRL释放因子，能促进PRL的分泌[1-8]。VIP通过位于细胞膜上的受体(vasoactive intestinal peptide receptor，VIPR)发挥其生理功能，已经证明禽类腺垂体PRL细胞的细胞膜上有VIPR-1，VIPR-1与VIP 在腺垂体特异性结合是引起PRL重新合成与分泌的信号转导的第一步[9-10]。目前，国内外对黑番鸭及家鸭VIPR-1基因的报道极少，郑嫩珠等[11]对黑番鸭VIPR-1的cDNA序列进行了克隆，并获得黑番鸭的部分cDNA序列。辛清武等[12]以黑番鸭基因组为模板进行PCR扩增，获取了黑番鸭VIPR-1基因第5外显子(101 bp)、第5内含子 (1 630 bp) 、第6外显子 (133 bp)、第12外显子 (42 bp)、第12内含子 (1 455 bp) 的完整序列和第13外显子 (176 bp) 的部分序列。

本研究以鸭VIPR-1基因作为影响鸭就巢性状的候选基因，选用就巢黑番鸭和非就巢黑番鸭为研究对象，通过PCR-RFLP和测序方法，对VIPR-1基因进行多态性检测，并进行相关性分析，研究该基因对黑番鸭就巢行为的影响，为黑番鸭的保护、开发利用及分子标记辅助育种工作提供依据。

1 材料与方法

本研究以黑番鸭为试验材料，颈静脉采血，提取总DNA，设计引物进行PCR扩增并采取PCR产物直接测序的方法寻找突变位点，然后再对PCR产物进行酶切与判型。

1.1 试验材料

选取就巢期黑番鸭68只，非就巢黑番鸭108只，采用颈静脉采血，EDTA抗凝，-20 ℃保存。基因组DNA试剂盒提取总DNA，TE溶解，-20 ℃保存备用。试验鸭饲养于福建省农业科学院畜牧兽医研究所种鸭示范基地-福建省莆田市泉发种禽开发有限公司，分子生物学试验在福建省农科院畜牧兽医研究所省畜禽分子遗传育种实验室进行。

1.2 主要试剂

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒均购自TIANGEN公司；DreamTaqGreenPCRMasterMix(2×)、Nuclease-freewater购自厦门鹭隆生物科技发展有限公司；pMD18-T载体、DNA Marker(DL1000、DL500)、限制性内切酶StuI均购自大连TAKARA公司。

1.3 黑番鸭VIPR-1基因多态位点及其引物

根据已克隆的黑番鸭VIPR-1基因内含子12的序列，设计一对引物，进行PCR扩增，扩增产物直接测序，寻找该序列的突变位点并进行酶切见表1。

1.4 PCR扩增

应用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取健康就巢黑番鸭68只、非就巢黑番鸭108只血液基因组DNA，进行PCR扩增反应，反应体系为50 μL：2 × Taq MasterMix 25 μL，上游引物(F) 1 μL，下游引物(R)1 μL，模板 DNA 2 μL ，补充ddH2O 至终体积50 μL。PCR 反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，53.5℃ 35 s，72℃ 45 s，共 35 个循环; 72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR 产物经 2% 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

表1 PCR引物序列信息Table 1 The amplification primer sequences

1.5 PCR产物的酶切与判型

将扩增结果良好的PCR产物用StuI酶切，反应体系为：10×M Buffer 2 μL，PCR产物10 μL，StuI 1 μL，加水至20 μL，37 ℃恒温水浴锅中消化过夜；3%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用DL1000和DL500的DNA Marker作为分子量的标准对照，观察酶切结果，凝胶成像系统拍照，由带型判断基因型。

1.6 数据统计与分析

计算各多态片段的基因频率和基因型频率，并用x2检验对不同基因型在非就巢和就巢黑番鸭中的分布情况进行显著性分析。

基因型频率 PAA=XAA/n；基因频率PA=(2PAA+PAG)/2n 。式中：n 为基因型总数量；XAA为其中一种基因型数目；PAA为AA 基因型的频率；PA为等位基因A的基因频率。

x2=n(ad-bc)^2/[(a+b)(c+d)(a+c)(b+d)]

式中：n=a+b+c+d为样本容量。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增与测序

所提取的血样DNA经检测纯度较高，可用于PCR扩增。PCR扩增结果如图1所示，扩增产物长度介于500～700 bp，扩增片段与预期片段大小一致且特异性较好，没有非特异性条带见图1，引物P的PCR产物经纯化回收后送往大连TAKARA公司进行测序，经序列比对发现片段中有一个核苷酸突变见图2，位于黑番鸭VIPR-1基因第12内含子的第988 bp(A/G)处，多态性即由此产生。

图1 PCR产物的电泳结果M.Marker DL1000;1-10.PCR 产物Fig.1 Electrophoresis of PCR productM.Marker DL1000;1-10.PCR product

2.2 酶切结果

PCR产物特异性较好，没有非特异性条带，可用于StuI限制性内切酶消化。经StuI酶切该PCR产物后，琼脂糖凝胶电泳检测，该位点表现为多态性，出现了AG、AA、GG 3种基因型，依据条带数和位置判定为3种基因型。其中等位基因A表现为607 bp一条带；等位基因B表现为362 bp、245 bp两条带，即有1个StuI酶切位点。因此，AA基因型个体表现为1条带(607 bp)，GG基因型个体表现为2条带(362 bp、245 bp)，AG基因型个体表现为3条带(607 bp、362 bp、245 bp)。就巢黑番鸭、非就巢黑番鸭部分酶切结果见图3。

图3 VIPR-1基因扩增产物的部分StuI酶切结果1，2，6，9，12，16，19，21.AG基因型；3，4，14，17，18.AA基因型；5，7，8，10，11，13，15，20，22.GG 基因型；M.Marker DL 500Fig.3 Profiles of PCR products digested by StuI of VIPR-1 gene1，2，6，9，12，16，19，21.AG genotype；3，4，14，17，18.AA genotype；5，7，8，10，11，13，15，20，22.GG genotype；M.Marker DL 500

2.3 SNPs与就巢性状的关系

VIPR-1基因内含子12片段经PCR-RFLP分析，在黑番鸭试验鸭群中检测到SNPs，其基因型分布情况详见表2。对黑番鸭试验鸭群进行SNPs基因型的检测，统计黑番鸭VIPR-1就巢与非就巢性状的基因型分布情况并进行卡方独立性检验。黑番鸭就巢与非就巢性状基因型分布结果见表3。卡方独立性检验结果表明黑番鸭VIPR-1基因第12内含子的第988 bp(A/G)处突变各基因型分布在就巢与非就巢性状中差异极显著(P<0.01)。

表2 内含子12片段的基因型频率和等位基因频率Table 2 Genotype and allele frequence of intron 12

表3 黑番鸭VIPR-1各基因型分布与就巢性状的关系Table 3 Distribution of genotype and appearance of broodiness in the balck Mouscovy duck

3 讨 论

血管活性肠肽受体-1(VIPR-1)与血管活性肠肽(VIP)在腺垂体特异性结合，可引起PRL的重新合成与分泌，可能对家禽的就巢有着重要的影响。因此，VIPR-1基因可作为研究家禽就巢性状的重要候选基因。You等[10]克隆出火鸡VIPR基因cDNA全序列，分析了VIPR在火鸡不同繁殖时期在下丘脑和垂体中的表达规律，并得出VIPR在垂体中表达量的变化与火鸡就巢密切相关。周敏等[13-16]研究鸡VIPR基因多态性，发现鸡VIPR基因存在多态位点，这些多态位点与鸡就巢的发生和持续时间显著相关；通过对VIPR-1基因C1704887T和C1715301T多态位点与优质肉鸡清远麻鸡鸡群开产性状、产蛋性状以及就巢性状的相关分析，发现位点C1704887T对总产蛋数与总正常蛋数存在显著影响；在选取VIPR-1基因的12个多态位点与优质肉鸡宁都三黄鸡群早期产蛋性状的相关分析中，发现有3个多态位点不同基因型对母鸡的早期产蛋性状存在显著影响；同时通过对鸡VIPR-1基因5’(-496～-1 bp)调控区多态位点与鸡就巢性的关联分析，发现多态以及单倍型组合与就巢性状紧密相关，可作为影响肉鸡就巢行为的候选基因进行深入研究。

本研究以与黑番鸭就巢相关的VIPR-1基因作为候选基因，利用PCR-RFLP和PCR产物直接测序法分析了该基因内含子12的核苷酸变异，经StuI酶切该PCR产物后，琼脂糖凝胶电泳检测，该位点表现为多态性，出现了AG、AA、GG 3种基因型，依据条带数和位置判定为3种基因型。其中等位基因A表现为607 bp一条带；等位基因G表现为362 bp、245 bp两条带，即有1个StuI酶切位点。通过对就巢黑番鸭与非就巢黑番鸭个体的研究，发现就巢黑番鸭只有一种基因型AG(68),而非就巢黑番鸭除基因型AG(45)外，还有基因型AA(18)、GG(45)，经卡方独立性检验，就巢黑番鸭与非就巢黑番鸭两者之间基因型的分布差异极显著(P<0.01)。表明黑番鸭VIPR-1基因第12内含子A988G突变与黑番鸭的就巢性状显著相关，为利用分子遗传标记辅助选择来降低或消除黑番鸭的就巢性，最大程度上提高黑番鸭的产蛋性能提供了新的依据。

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