胞浆内核酸受体RLRs的研究进展＊

廖 倩，吴谡琦，孙修勤

（国家海洋局 第一海洋研究所，山东 青岛266061）

机体的固有免疫系统在抵抗病毒感染方面发挥着重要作用。病毒感染宿主细胞后，宿主细胞可以通过模式识别受体（Pattern Recognition Receptors，PRRs）监测病原相关分子模式（Pathogen－Associated Molecular Patterns，PAMPs）的存在，从而激活宿主的固有免疫反应，诱导干扰素（Interferon，IFN）、促炎症细胞因子等一系列抗病毒因子的产生。除了RLRs（RIG－I Like Receptors）之外，目前已发现的PRRs还包括：TLRs（Toll Like Receptors）、CLRs（C－type Lectin Receptors）以 及 NLRs（Nucleotide Oligomerization Domain－Like Receptors）等［1－2］。Toll样受体家族是一类重要的PRRs，在病毒的识别过程中发挥重要作用，如TLR3识别dsRNA；TLR9识别病毒或细菌DNA包含的非甲基化CpG等。但由于TLRs家族成员均为跨膜蛋白，只能识别细胞外或靠近胞内膜的病毒，对于细胞质中的RNA病毒，TLRs则不易做出反应。RLRs则是存在于胞浆中的1个具有Asp－Glu－X－Asp/His（DExD/H）特征基序的RNA解旋酶家族，能够通过识别胞浆内的病毒核酸，将信号传递给转录因子，从而活化I型干扰素的合成并诱导其它抗病毒相关基因的表达［1］。因此，RLRs在抗病毒免疫应答方面具有极其重要的作用。

1 RLRs的结构、功能及分布

目前已发现的 RLRs成员有3个，分别为视黄酸诱导基因I（Retinoic Acid－inducible Gene I，RIG－I）、黑色素瘤分化相关基因5（Melanoma Differentiation Associated Gene 5，MDA5）与LGP2（Laboratory of Genetics and Physiology 2）。上述3个分子具有相似的结构，含有3个基本结构域包括：1）N末端的CARD结构域（Caspase Activation and Recruitment Domain，CARD），由1个或2个线性排列的CARDs串联而成，为半胱天冬酶活化与招募结构域（LGP2中缺失）；2）中间的解旋酶结构域，属于RNA解旋酶DExD/H家族，包含9个短的基序：Q，I，Ia，Ib，II～VI（基序I、II又分别称为 Walker A、B模体）9个短的基序；3）C末端结构域（C－terminal Regulatory Domain，CTD）。MDA5的CARD结构域，解旋酶结构域及CTD与RIG－I的相应结构域之间的同源性分别为23%，35%，30%［3－4］。RIG－I的解旋酶结构域及CTD与LGP2的相应结构域之间的同源性分别为31%，29%。另外，MDA5的解旋酶结构域及CTD与LGP2的相应结构域之间的同源性则分别为41%，34%［5］。

RLRs的CARD结构域通过与线粒体连接蛋白 MAVS（Mitochondrial Antiviral Signalling Protein）的CARD同源结合启动下游信号传导过程，从而在线粒体相关复合体处募集并活化更多的信号分子（LGP2由于缺失CARD结构域因而不参与信号传导过程）；解旋酶结构域能够水解ATP，同时与RNA结合（也可能促使RNA的解聚）；CTD可与dsRNA或5＇ppp－ssRNA结合形成共同结构，并由此决定了不同RLRs与病毒RNA结合能力的强弱，同时在RIG－I中CTD结构域还具有自我调节功能，即在缺少RNA配体的条件下，CTD与CARD间会形成一个紧密的结构，从而阻止其下游信号的传递［3，6］。

RLRs通常在绝大多数组织的细胞中低量表达，在病毒和干扰素的刺激下RLRs的表达会迅速上调［3］。在小鼠和人的成纤维细胞、巨噬细胞和常规树突细胞（Convential Dentric Cells，cDCs）中RIG－I为主要监测细胞质RNA病毒感染的分子［3］。在非极化上皮细胞中，RIG－I位于膜脊上，与细胞骨架上的F－肌动蛋白存在相互作用，而MDA5位于胞质中，与肌动蛋白间无明显的共分布，同时发现RIG－I在极化上皮和内皮细胞的顶端结点也有分布，而MDA5则无此分布［6］。

2 RLRs对外源核酸的识别

无论是先天免疫或是适应性免疫，其核心均在于对免疫原的正确识别。RLRs能够直接识别RNA病毒核酸并产生相应的应答，而对DNA病毒核酸则需经RNA聚合酶Ⅲ作用产生5′ppp－ssRNA后才能间接识别。与RNA结合后，RIG－I与MDA5经过ATP依赖型的构象变化，其N末端的CARD暴露且诱导寡聚化，使得CARD与线粒体连接蛋白MAVS（也称IPS－1，VISA或Cardif）的CARD相互作用而起始下游信号的传递［3］。

2.1 RLRs对RNA病毒的识别

尽管RIG－I与MAD5的结构相似，但其识别的病毒却明显不同。目前的研究显示，MDA5主要识别小RNA 病毒如脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）、脑脊髓炎病毒（Theiler＇s murine encephalomyelitis virus，TMEV）、门戈病毒（Mengo virus，MV）及相对长的polyI：C（大于2kb）；RIG－I主要识别的RNA病毒包括甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV），水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV），新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV），呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）等及相对短的polyI：C（通常小于1kb）。同时也存在部分病毒都能被RIG－I及 MDA－5识别，如登革病毒（Dengue virus，DEN），西尼罗河脑炎病毒（West nile virus，WNV）和呼吸道肠道病毒（Reovirus，RV）。这表明 RIG－I与MDA5在功能上有部分重合的［3］。

对于特定病毒的识别，RIG－I与MDA5呈现高度的细胞特异性。在受仙台病毒（Sendai virus，SeV）感染的MEFs细胞中，SeV由RIG－I来识别，而在cDCs中，主要由MDA5负责SeV的识别［7］。然而关于细胞对病毒特异性的识别是由受体的差异性表达引起，还是由不同细胞中病毒复制的差异性引起的机制目前尚不明确。

从病毒的本质来看，RIG－I特异性的结合5′ppp－ssRNA，从而产生相应的免疫应答［8］。然而，不同学者的实验表明5′ppp－ssRNA需要碱基配对结构才能通过RIG－I活化抗病毒信号途径，且此RNA的结构为短的平末端5′ppp－dsRNA［3］。因为在负链RNA病毒的单链基因组的锅饼结构域含5′三磷酸的平末端短双链RNA，所以，RIG－I可以检测的负链RNA病毒［3］。由于小RNA病毒的基因组RNA及其复制中间体RNA的5′末端不被磷酸化，其是与一种小蛋白Vpg共价结合，所以小RNA病毒是由 MDA5而非RIG－I识别的［8］。

从病毒的免疫逃逸角度也可看出RLRs的抗病毒感染中的作用。在EMCV感染过程中，病毒编码的3C蛋白酶与半胱氨酸蛋白酶共同作用可致RIG－I降解，因此阻断了细胞的抗病毒途径［9］。另外，在脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）感染的细胞中，MDA5可被蛋白酶体、半胱氨酸蛋白酶而非蛋白酶2A或3C的作用下降解［10］。这被认为是病毒演化出的一种抵抗因病毒感染诱导宿主细胞产生I型IFN，有利于病毒的增殖的机制。甲型流感病毒的非结构蛋白可与RIG－I相互作用，进而阻断了RIG－I的抗病毒信号实现了病毒的逃逸［8］。HCV则通过编码蛋白酶NS3/4A作用于宿主细胞MAVS的C端，使MAVS不能在线粒体上发生寡聚化进而阻断RIG－I信号通路，造成细胞不能传递病毒入侵的信号［3］。

哺乳动物中LGP2可影响RIG－I和MDA5对RNA病毒的识别。当LPG2缺失时，RIG－I和MDA5诱发的抗病毒效应都会减弱［11］。但另一方面也有研究显示LGP2可作为抗病毒效应的反馈抑制子与MAVS形成复合物，从而抑制RIG－I与 MDA5诱发的抗病毒效应［12］。此外，另有研究发现LGP2对EMCV和VSV的感染分别起着相反的作用，即LGP2对MDA5和RIG－I的抗病毒应答分别起到正负调控的作用［13］。Pippig Diana A.等［14］发现LGP2的RNA结合区结合能力最强，而MDA5的最弱，并提出了LGP2对RIG－I及MDA5的调节模型：dsRNA结合至LGP2的C末端及DExH基序，从而竞争性抑制了dsRNA依赖的RIG－I的激活：完整的LGP2又可以与 MDA5共同识别dsRNA以增强MDA5介导的信号转导。虽然LGP2对其它RLRs的调控作用目前还没有定论，但上述结果明确说明LGP2在RLRs所组成的抗病毒体系中也起到了重要的作用。

2.2 RLRs对DNA病毒的识别

正常细胞需要合成自身所需的RNA，但这种RNA需要经过多种不同方式的加工，才能保护了正常产物不被RIG－I或MDA5所识别，如mRNA需要在5′端加上7－甲基鸟苷、tRNA经过5′切割和一系列核苷酸的修饰、rRNA与核糖体蛋白结合成为核糖核蛋白体等。然而，无论是由于感染而新进入的病毒RNA，还是由于病毒复制而产生的RNA都包含着非自身的标记5′三磷酸。因此，由DNA病毒产生的5′ppp－ssRNA可能被RIG－I很好的检测。

研究表明HEK293细胞中，胞浆dsDNA诱导IFN－β的产生被MAVS的基因沉默部分抑制，说明MAVS在人类细胞中可能介导了dsDNA的信号传导［15］。在Huh－7细胞中RIG－I及MAVS在对于dsDNA诱导的IFN－β启动子的活化是必需的。进一步蛋白质相互作用的Pull down分析结果表明RIG－I虽然介导了dsDNA的信号级联反应，但可能并不直接与dsDNA结合，而是依靠上游信号分子识别dsDNA，然后通过RIG－I的信号传导途径诱导IFN－β的表达［16］。与之对应，Andrea Ablasser等［17－18］发现了1条与 RNA 聚合酶III（RNA Polymerase III RNA Pol－III）及RIG－I相关的DNA病毒识别途径，在此途径中富含AT的dsDNA作为RNA Pol－III的模板，转录成含5′三磷酸的dsRNA，进而活化RIG－I并诱导I型干扰素的产生同时活化转录因子NF－κB。因此，RNA聚合酶III及RIG－I对于病毒DNA的识别至关重要。

进一步研究发现人类细胞中也存在RNA Pol－III MDA5DNA识别途径［19］。另外，在lgp2－/－MEFs细胞中，胞浆dsDNA分子poly（dA－dT）转染进入细胞后，与野生型细胞相比，LGP2的缺失减弱了细胞对poly（dA－dT）等的反应。体外研究也发现LGP2蛋白并不与DNA结合，而是间接介导了细胞对DNA的反应，这表明LGP2也可能通过胞内RNA Pol－III途径产生免疫应答［20］。以上研究表明，RLRs很可能都通过RNA Pol－III的识别在DNA病毒的识别应答中起重要作用。

3 RLRs的信号传导途径

尽管RIG－I与MDA 5识别的对象有所差异，但它们都遵从相同的信号传导途径。RLRs信号通路的第1个下游接头分子是线粒体连接蛋白MAVS［21］。MAVS通过其不同的结构区域能够与一系列信号分子发生相互作用，如 FADD（Fas－Associated Death Domain－containing）和 RIP1（Receptor－Interacting Protein 1），TRAF2（Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor 2），TRAF6（Tumor Necrosis Factor Recepetor Associated Factor 6），TRAF3（Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor 3），MITA（Mediator of IRF 3Activation）等，通过IRF3（Interferon Regulatory Factor 3），IRF7（Intorferon Regulatory Factor 7），NF－κB级联传递，最终诱导促炎症细胞因子和I型干扰素的表达［21－28］。RLRs的基本信号通路如图1所示。

图1 RLRs的信号传导通路Fig.1 RLRs－mediated signaling pathway

RIG－I与MAD5作为胞浆内核酸受体可识别胞浆的RNA分子，与下游信号分子MAVS相互作用，招募 TRAF3，TRAF2，CARD9（Caspase Recruitment Domain－Containing Protening 9），FADD 及RIP1，MITA等下游接头分子［21－28］。激活的TRAF3，MITA通过TBK1－IKKi，IRF3和IRF7活化激酶激活转录因子活化IRF3及IRF7［24，26］。激活的 TRAF2，CARD9则分别通过与 TAK1－IKK，BCL10（B－cell lymphoma 10）的作用活化 NF－κB［21，23］。激活的FADD及 RIP1则直接活化 NF－κB［21］。IRF3，IRF7及 NF－κB的活化诱导促炎症细胞因子和I型干扰素的表达，以抵抗病毒的感染［3］。其中，MITA位于线粒体或内质网上，与E3泛素连接酶RNF5的泛素化作用有关［24］。不同学者研究中，TRAF6在信号途径中的作用出现不一致的结果，因此需要进一步的实验加以确认。

其中，MAVS是1个同样具有CARD基序的膜结合蛋白。除了CARD基序外，MAVS还有富含脯氨酸的中间区域，以及C端的疏水跨膜结构域（Transmembrane Domain，TM）［29］。剔除实验分析显示MAVS的CARD结构域和TM（可使MAVS其定位于线粒体外膜）结构域对于其信号传导功能都是必需的［21］。同时，据最新报道称，MAVS在线粒体上通过其C端形成的寡聚化，此寡聚化对于MAVS向下游传递信号也是必需的［30］。MAVS与RIG－I或MDA5之间同源CARD－CARD特异性的相互作用启动了信号传导途径。

4 RLRs与其它抗病毒免疫途径的交联

如前所述，RLRs并不是产生抗病毒免疫应答的唯一途径，而是与其它PRRs一同相互协调提供机体对病毒的免疫保护。黄病毒（Flavivirus）中的WNV感染小鼠很好地体现了不同PRRs之间的相互协调作用。WNV病毒感染初期进入皮中的朗罕式细胞和/或成纤维细胞，感染细胞的RLRs诱导局部IFN的分泌及其它先天免疫应答，进而控制病毒进入外周血。然而，一旦病毒突破皮肤屏障进入引流淋巴结中的巨噬细胞和cDCs进行复制，这些细胞的RLRs，TLRs就会启动多种IFN与促炎症细胞因子的合成，因而形成局部的炎症反应。RLRs在应答中是监控WNV感染并触发胞内先天免疫应答的关键因子，而TLRs则是产生特定细胞因子并启动适应性免疫的根源。TLRs及多种辅助因子的表达受到IFN的调控。因此，起始的RLRs信号传导及IFN的合成对于强化TLRs的表达及其免疫效应有重要作用。RLRs途径通过影响MyD88依赖的信号途径介入到TLRs的抗WNV病毒感染过程［31－32］。另有研究发现MAVS可参与到TLR3的下游信号途径中，这进一步说明RLRs与TLRs信号途径间存在关联［28］。

由此可见，机体的抗病毒感染都是通过多种免疫途径实现的，而不同途径之间存在复杂的协调关系，以确保生物体产生正常的免疫应答。

5 鱼类RLRs的研究进展

在鱼类中，RIG－I的研究最早在大西洋鲑鱼（Salmosalar）细胞系TO及鲤鱼（Cyprinuscarpio）细胞EPC中进行。Stéphane Biacchesi等［1］鉴定了编码 RIG－I样分子及 MAVS的序列，且证实 RIG－I、MAVS在这些细胞中的过量表达诱导了IFN及IFN诱导基因的表达，从而实现了细胞对RNA病毒感染的完全保护，同时证明了TO细胞中MAVS位于线粒体膜上。随后，在草鱼（Ctenopharyngodonidella），金鱼（Carassiusauratus）中也克隆出RIG－I基因，并从mRNA水平及鱼类细胞的病变两方面研究了RIG－I在抗病毒中的作用［33－34］。MDA5及 LGP2 基因也相继在草鱼、牙鲆（Paralichthysolivaceus）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）及金鱼中被克隆出来，并对它们在抗病毒中的作用进行了初步研究［35－37］。另外，在虹鳟鱼中发现了1个截短形式的LGP2异构体，其在LGP2的信号传导中起负调控的作用。与哺乳动物LGP2调控MDA5信号途径的功能不同，虹鳟鱼的LPG2与MDA5可能在抗病毒反应中独立发挥作用［38］。在斑马鱼（Danio rerio）、草鱼、大西洋鲑、牙鲆及虹鳟中也先后发现了MAVS基因，但斑马鱼MAVS基因没有表现出特异定位于某个亚细胞器的特征，这可能是因为斑马鱼MAVS基因缺失了人同源基因的C端跨膜结构域［38－39］。这些结果说明鱼类的MAVS细胞分布可能与哺乳动物有所不同。

6 展望

RLRs作为新发现的PRRs，其在病毒核酸识别中的重要性已经得到证实，但仍有许多问题尚待解决。首先，在RLRs途径中，LGP2对RIG－I与MDA5中起到了正或负调控的作用，它是如何确定调控作用的方向，这其中的机制急需解决以更加完善RLRs抗病毒信号通路。其次，已知RIG－I与MDA5对不同的RNA病毒起到识别作用，而有证据表明同一病毒对不同细胞的感染分别由RIG－I与MDA5来识别，这些细胞是如何决定何受体发挥作用的，RIG－I与MDA5是如何分工，需要更进一步的研究加以明确。另外，我们需要了解RLRs与TLRs信号途径对不同病毒的识别应答是如何协作以实现机体更好的自我保护的。为了明确RLRs通过RNA Pol－III的识别在不同DNA病毒的识别应答中起重要作用，更多的研究需要我们去进行。

鱼类是已知兼具固有与获得性免疫最低等的脊椎动物，也具有完全的体液和细胞免疫应答。鱼类属于变温动物，淋巴细胞的增殖较为缓慢，获得性免疫应答的发生相对滞后（可长达12周）。另外，在进化上鱼类的免疫系统也不如高等动物完善，抗体的亲和力、抗体库的大小均明显低于哺乳类，这些决定了鱼类的固有免疫系统在抵抗病原体感染的免疫应答中作用比哺乳动物更为重要。如前所述，RLRs在哺乳动物中的研究相对丰富，而目前在鱼类RLRs领域的研究资料仍相当匮乏。作为控制病毒感染的关键途径，鱼类RLRs相关的基础研究不仅对于经济养殖鱼类病毒性疾病的免疫防治研究方面具有重大意义，同时还由于鱼类在进化中的特殊地位，使其对完善以高等哺乳类为基础建立起来的免疫学知识具有重要作用。随着鱼类研究在细胞培养、蛋白质组、基因组等技术领域的发展，对鱼类RLRs信号传导途径及其分子机制的深入研究将为重大传染性疾病的免疫防治、新型药物的开发以及高等生物抗病毒免疫体系等方面提供重要的科学依据。

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