胚胎发育早期神经上皮的显微移植技巧及应用

白仲添，严 俊，孟文勃，张 磊，周文策，李 汛

(1．兰州大学第一医院普外二科，甘肃省肝胆胰外科研究所，兰州大学临床医学院肿瘤防治中心，甘肃兰州 730000;2．Department of Neuroanatomy，Institute of Anatomy，University of Bonn．Germany 53115 Bonn)

脊椎动物的头部运动神经元的胞体位于脑干， 其轴突通过脑神经的迁移，支配头颈部肌肉的运动［1］。而且，来自于鸡、小鼠或人类等羊膜动物胚胎的神经嵴细胞(neural crest cells，NCCs)越来越成为人们研究动物组织器官命运决定的焦点［2］。发育早期，头部神经管发生一系列卷曲，发育为前脑、中脑和后脑。尾端神经元保持狭窄并拉长，形成脊髓。运动神经元向腹侧分化并形成于基板。头侧的运动神经元轴突在脑干依据背-腹侧路线迁移，其轴向位置穿过出口点(exit point)到达周围的眼肌、舌肌、鳃弓或副交感神经节［3］。尽管近年来人们从分子生物学角度发现了许多支配运动神经元迁移的吸引性或排斥性信号分子，但是运动神经元轴突在神经管内迁移、寻找出口点以及最终到达靶位的每一个阶段，是哪些因子在其迁移和轴突寻路中起关键作用，目前仍然是研究的焦点［4］。神经嵴细胞是脊椎动物最为关注和重要的祖细胞，其在组织衍生中有非常宽泛的衍生能力。而且其中一些衍生物在成年组织中持久存在，并保持着祖细胞的一些多能性特征［5］。而且，神经嵴细胞还可以衍生为肿瘤细胞，而且，异常的启动子甲基化在这类细胞中普遍存在［6］，因此，神经嵴细胞的衍生，迁移及轴突导向的功能为肿瘤生物标记物的研究开辟了一条新的途径。目前对于神经嵴细胞的迁移及分化特性的了解，有很多分子生物学的解释。但是，内在和外在的影响如何随着时间的推移，引导它们在空间上适当分化?什么因素调节着神经嵴细胞多能性的维持?在多种疾病中，神经嵴细胞能否应用于细胞替代治疗，以影响神经嵴细胞来源组织的增殖和发育?他们能否应用于组织工程?这些问题都有待于进一步研究。近年来，涌现出了许多研究胚胎发育和轴突寻路、神经嵴细胞迁移的发育生物学研究方法，包括免疫化学染色、神经染料逆行跟踪、病毒示踪、神经上皮移植等多种方法［7］，但每一种方法都存在许多缺陷，需要在研究中不断的更新并走向成熟。

显微移植技术是制备转基因动物、动物克隆和嵌合体动物制作的必备方法之一［7－10］。在动物克隆研究中，显微手术对克隆是否成功具有重要的意义。同样，在胚胎发育早期的神经上皮移植及神经嵴细胞的移植中，胚胎的前期处理、显微移植针及吸管的制备或操作方法对移植的成功起到关键的作用。本文结合我们实验室多年来的显微移植经验，将神经上皮及神经嵴细胞移植的方法，包括胚胎前期处理、显微针及毛细吸管的制备，嵌合体的制备、神经上皮的移植，神经管、神经嵴细胞及体节等移植的操作方法、技巧及注意事项介绍如下。

1 实验材料制备

1.1 显微操作针的制备

显微操作针由钨针、毛细玻璃管构成。将尖端口径为2 mm的薄壁毛细玻璃管在酒精灯上拉制，使得管腔比钨丝直径稍大，将3 cm左右长度的钨丝插入毛细管管腔(插入深度为0.5～0.8 cm为宜)，将毛细管管口在酒精灯下煅烧，使得玻璃融化，以完全固定钨丝。市场购买12 V、3 A交流变压器一个，利用绝缘导线将负极插入装有电解液的杯底(电解液配方见附件)，将正极与暴露于玻璃管的根部钨丝接触，并缓缓插入电解液并缓缓提起数次，直到钨丝变细到针尖肉眼不可及为止。将钨针倒放在不可触及的干净地方备用。

1.2 毛细吸管的制备

毛细吸管主要由毛细管和套在末端的长40 cm左右的橡皮吸管构成。将上述的毛细玻璃管在酒精灯下手工拉制成管腔适合的吸管备用(毛细吸管的粗细由拉针速度决定)。也可用拉针仪制备合适形状的玻璃吸管。根据移植组织的大小选择合适的玻璃吸管。

1.3 染色棒的制备

染色棒主要用于早期胚胎移植块(神经上皮、神经嵴细胞或体节)的染色，便于观察。将适度拉长的玻璃管在酒精灯上煅烧，使玻璃管尖端融化成表面圆润光滑、直径1～2 cm的玻璃球。将染色棒的球端浸在提前配好的Nile blue溶液染液中2～3次，染液刚好没过玻璃球为宜，使染料充分粘在玻璃球上，晾干备用。

Nile blue溶液制备:0.25 g琼脂糖溶于10 mL双蒸水中。然后加入0.1 g Nile blue充分搅拌使其溶解。用前端形成直径1 mm小球的玻璃管反复沾取溶液使小球沾满带有Nile blue的琼脂糖并常温晾干备用。

2 实验方法

2.1 胚胎的前处理

本文以鸡胚为例，说明显微移植的操作方法。胚胎发育分期严格按照HH标准［11］。

Locker溶液配制:母液 A:94.270 g NaCl溶于1 000 mL双蒸水;母液 B:12.0253 g KCl溶于1 000 mL双蒸水;母液C:15.8092 g CaCl2*H2O溶于1 000 mL双蒸水;100 mL A+37 mL B+21 mL C+0.03 g青霉素，然后加双蒸水至1 000 mL，高温高压灭菌后备用。

将孵化到预定时期的受精鸡蛋在照蛋器上寻找胚胎(早期胚胎呈圆形黑点)，并用铅笔在鸡蛋上划出胚胎的位置，为了观察方便，最好选用白皮鸡蛋。将鸡蛋平放在小托盘上，胚胎轴心垂直于地面朝上。用尖形镊子轻轻在气室部扎一小孔，用锯齿为1～1.5 mm的锯条与胚胎面呈20～30度角轻轻摩擦蛋壳，开取与黑点大小相当的正方形窗口，用眼科镊子小心撕开卵壳膜，用吸管小心滴加Locker液，直至胚胎浮于窗口，并继续加液使窗口形成一凸起的水球(凸面水球起放大镜的作用)，反复调试光源位置直至反射出白色胚胎。

显微移植种类主要分为同位移植和异位移植，两种移植都可用于嵌合体动物模型中。同位移植指将供体胚胎的切取片段移植于受体胚胎的同一部位。异位移植指将供体胚胎的切取部位移植于受体胚胎的不同部位。在鸡胚或鹌鹑胚胎的早期发育中，如HH8-13期，神经管经历开放到闭合的过程。神经管上1/3段主要分布轴突出口(exit point)，在神经管背侧，散在分布大量的神经嵴细胞［12］。在这一时期，神经元胞体主要位于神经管下1/3段。体节1～3段的神经管后来主要发育为第三、第五、第七对脑神经;体节4～7段的神经管后来主要发育为第九、第十、十一对脑神经;体节8段以后主要发育为脊神经［13－14］。手术操作一般为一侧神经管，另外一侧神经管可做对照组(图1)。

2.2 神经元胞体移植

2.2.1 受体胚胎处理:体示显微镜下，在需要移植的部位沿背中线小心切开神经管(切口不要太大，以防移植片段滑落)，用显微切割针沿神经管下2/3段位置小心切下腹侧神经管。等待移植。

2.2.2 供体胚胎处理:沿背中线切开神经管使其呈开口状。选择合适大小的染料棒小心涂抹供体移植部位的下1/3段神经管使其染色。用显微切割针沿轴向小心切除移植部位上2/3神经管。沿垂直于纵轴的方向剥离开下1/3段神经管最后沿基板方向切下神经管，尤其注意在切的过程中，注意标记方向，可用染料深浅标记，也可用切片的形状标记(图2)。

从供体胚胎切下的片段吸入毛细吸管，轻轻吹入受体胚胎表面，调整方向，用显微切割针轻轻夹入受体切开的部位。用5 mL注射器从气室开口处缓慢吸取蛋清使胚胎下陷1～1.5 cm，用透气无菌胶布封口，放入孵化箱孵化到预定时期。将孵化后的胚胎从孵化箱中取出，用眼科剪刀从窗口剪开拇指大小的窗口，剪开卵黄膜，用直径1 cm的漏勺将胚胎取出，放入Locker液中清洗，做后续实验。

图1 神经管解剖示意图Fig．1 Schematic diagram of the neural tube anatomy

图2 胚胎发育早期运动神经元胞体移植示意图Fig．2 Schematic diagram of the transplantation of motor neurons at early embryonic development

2.3 神经管移植

神经管移植主要用于脑运动神经轴突寻路的标记。将鹌鹑胚胎神经管移植入鸡胚，在后续实验中，用鹌鹑特异性抗体QCPN染色，可显示嵌合体中该段神经管内运动神经轴突的迁移轨迹。如将分布第XI对脑神经的神经管移植入分布脊神经的神经管处，由于第XI对脑神经副神经的迁移特性，其在脊神经部位形成一个副神经的特异性轴突运动轨迹(图3)。

图3 神经管异位移植示意图Fig．3 Schematic diagram of hetero-transplantation of the neural tube

2.4 神经嵴细胞移植

调节神经嵴细胞迁移的内外调节因子的研究目前已有很多文献报道。神经嵴细胞是羊膜动物最为重要的祖细胞，其具有非常广泛的衍生能力。而且其中一些衍生物在成年组织中持久存在，并保持着祖细胞的一些多能性特征。近年来神经干细胞在肿瘤生物治疗中的作用越来越受到人们的重视，Etchevers最先在Nature Protocol上发表了关于神经嵴细胞体外原代培养的文章。因此，神经嵴细胞的体外扩增和临床应用会越来越多的受到人们的关注。神经嵴细胞的取样和显微移植，对于中枢神经系统及器官发育及其神经调节，以及临床治疗都具有重要的意义。

3 显微移植的问题与展望

显微移植是一项需要较强的耐心和细致心。在移植过程中，每一个环节都起着至关重要的作用，包括操作针的粗细、吸管管口的平整度、蛋壳窗口的大小、胚胎时期的确定、移植片段的方向等等。只要在操作中多思考，多练习，并严格按照成熟的方法操作，一定会取得理想的移植效果。

自上世纪末以来，在运动神经轴突寻路、神经嵴细胞的产生、迁移及其作用的研究中，除了基因敲除和基因沉默技术等技术的应用外，胚胎早期发育的神经组织移植以及神经嵴细胞的切除发挥了开辟性的作用。最近，又攻克了神经嵴细胞的体外培养。对头运动神经轴突导向，特别是头-尾、背-腹特异性因子如何调节运动神经元特异性等方面，取得了突破性进展。但是，各种吸引性或排斥性信号分子并不是单一作用于轴突寻路或神经嵴细胞迁移的，而是多种内外因子相互作用的结果。因此，对于各种物理、化学因子的联合作用研究，仍然需要完善。这就需要在发育早期，将显微手术、基因敲除、电转、乃至于干细胞体外培养等联合起来进行研究，最终将阐明的脑神经的特异遗传结构，信号通路及寻路策略等应用于临床，比如脑神经瘫痪、运动神经元疾病及肿瘤［15］。

［1］ Guthrie S．Patterning and axon guidance of cranial motor neurons［J］．Nature Rev Neurosci，2007，8(11):859 －871．

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