E2F1基因敲除小鼠骨髓造血干、祖细胞减少

石桂英，葛文平，张连峰，白 琳

(中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

细胞内重要的转录因子E2F1是E2F家族中第一个被克隆出来的蛋白，对细胞的增殖、分化和凋亡都发挥着关键性的作用。E2F1参与了细胞周期从G1期到S期的转换:在细胞周期G1期前，Rb与E2F1结合限制了其活性，当细胞周期蛋白激酶CDK结合蛋白Rb后，磷酸化的Rb释放E2F1/DP-1复合物，这样E2F1/DP-1就结合到基因组上，发挥转录调控功能激活下游基因，进而使细胞周期从G1期转换到 S 期［1，2］。同时，E2F1 还发挥促凋亡功能，通过p53依赖型以及p53非依赖型两种细胞信号通路，进而激活下游促凋亡蛋白如:Bcl-2、homology3(BH3)-only proteins PUMA、Noxa、Bim、Hrk/DP5、Bik 以及 caspase-3、-9 等［3－6］;此外，E2F1还抑制细胞存活信号通路分子如:NF-κB、Mcl-1等［7，8］。通过E2F1这两方面的作用，最终带来细胞的凋亡。

已有研究发现，E2F1基因敲除小鼠胸腺增大，进一步研究发现，其机制是E2F1基因敲除后抑制成熟胸腺细胞的凋亡，从而使胸腺细胞数增多，体积增大［9］。那么，E2F1基因敲除对骨髓造血干、祖细胞是否也有影响，目前未见相关研究。本研究应用流式细胞仪分析E2F1基因敲除小鼠的外周血、脾脏、骨髓等组织细胞，了解E2F1基因敲除对上述组织细胞及造血干、祖细胞的作用。

1 材料和方法

1.1 动物与设备

E2F1基因敲除小鼠来自北京协和医学院比较医学中心，遗传背景为129，对照小鼠为同窝野生型小鼠，动物生产及使用许可证号:【SCXK(京)2009-0007;SYXK(京)2011-0022】。主要实验设备为美国BD公司Aria流式细胞仪。

1.2 PCR方法鉴定E2F1基因敲除小鼠基因型

用10日龄小鼠尾尖提取基因组 DNA，普通PCR鉴定基因型。反应条件:94℃预变性3 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个循环;72℃延伸10 min。基因敲除小鼠的 PCR鉴定引物:oIMR0580:5'-GGATATGATTCTTGGACTTCTTGG-3'，oIMR0581:5'-CTAAATCTGACCACCAAACGC-3'，oIMR1997:5'-CAAGTG CCAGCGGGGCTGCTA AAG-3'，PCR产物长度，野生型为172 bp，E2F1敲除为227 bp，杂合子同时有上述两条片段。引物由上海英骏生物工程技术有限公司合成，PCR试剂购自宝生物工程有限公司。

1.3 流式分析

小鼠脱颈椎处死后，取脾脏、后肢骨，置于冰上预冷的染色缓冲液(含1%BSA的PBS)中。脾脏用磨砂玻片研磨成细胞悬液;后肢骨用5 mL注射器将骨髓细胞冲出，并吹打成细胞悬液。将细胞悬液用50 μm尼龙滤膜过滤后收集到15 mL离心管中，用PBS定容至10 mL，混匀后，取10 μL细胞悬液，稀释10倍后计数细胞数。细胞悬液离心，1 000 r/min，10 min，将细胞浓度调整为1×108个细胞/mL。分别取106细胞标记荧光抗体(BD公司)。

骨髓造血干细胞的分析中用如下抗体进行标记:CD34-FITC、Flt3-PE、CD16/32-Percp-cy5.5、Sca1-PE-Cy7、cKit-APC、Ter-119-biotin、Gr-1-biotin、Mac-1-biotin、B220-biotin、IL-7R-biotin、CD4-biotin、CD8-biotin、biotin-APC-Cy7。骨髓造血干细胞(HSC)表面标记为:lin-c-kit+sca1+，长期造血干细胞(LT-HSC)表面标记为:Lin-c-Kit+Sca1+CD34－Flt3－，短期造血干细胞(ST-HSC)表面标记为:Linc-Kit+Sca1+CD34+Flt3－，髓系祖细胞(MP)表面标记为:Lin-c-Kit+Sca1－，共同髓系祖细胞(CMP)表面标记为:Lin-c-Kit+Sca1－CD34－CD16/32low，粒单系祖细胞(GMP)表面标记为:Lin-c-Kit+Sca1－CD34+CD16/32high，巨核单系祖细胞(MEP)表面标记为:Lin-c-Kit+Sca1－CD34+CD16/32low。IgDFITC、CD43-PE、B220-PE-Cy7、IgM-APC，标记不同发育阶段的B淋巴细胞。脾脏及外周血细胞标记抗体:CD4-FITC、 CD8-Percp-cy5.5、 B220-PE-Cy7、CD11B-APC-Cy7。上述抗体加入细胞悬液，冰上避光，30 min;加1 mL 染色缓冲液，离心，2600 r/min，5 min，弃上清液，加200 μL染色缓冲液重悬细胞，用50 μm尼龙滤膜过滤，冰上避光备用。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0软件包进行统计分析，各组数据均采用ˉ±s表示。组间资料分析采用t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR鉴定结果

剪取10日龄小鼠脚趾，采用饱和氯化钠法提取小鼠基因组DNA，进行PCR，产物经2%琼脂糖凝胶电泳，野生型产物长度为172 bp，E2F1缺失产物长度227 bp。基因型鉴定结果见图1。

2.2 E2F1基因敲除小鼠骨髓B细胞减少

已有研究发现，与野生型小鼠相比，E2F1基因敲除小鼠的胸腺明显增大，胸腺细胞总数显著增多［9］，而对外周血、脾及骨髓等未见相关研究。本研究中亦发现E2F1基因敲除小鼠胸腺明显增大(图2A)。我们对E2F1基因敲除小鼠及同窝野生对照小鼠的外周血、脾、骨髓中 B220+、CD4+、CD8+、CD11b+细胞进行流式分析。结果发现，与野生型小鼠相比，E2F1基因敲除小鼠外周血中CD4+细胞显著增多，而CD11b+细胞显著减少，骨髓中B220+细胞显著减少，CD8+细胞显著增多，脾脏中各种细胞的比例无明显差异(图2B、C，脾脏细胞分析图未显示)。可见，E2F1基因敲除对造血系统各种细胞均有重要影响。

图1 E2F1基因敲除小鼠鉴定结果Fig．1 Genotyping of the E2F1 knockout mice

2.3 E2F1基因敲除小鼠髓系祖细胞及前体B细胞减少

CD11b+细胞由髓系祖细胞发育而来，我们分析了髓系祖细胞及各单系祖细胞的变化。结果显示，E2F1基因敲除后，髓系祖细胞及各单系祖细胞数量均显著减少(图3A)。对B细胞发育的流式分析结果发现，前体B细胞及未成熟B细胞均显著减少，而成熟B细胞的比例显著增加(图3B)。这说明E2F1基因对髓系及B细胞发育有重要作用。

2.4 E2F1基因敲除小鼠骨髓造血干细胞减少

图2 E2F1基因敲除影响外周血及骨髓细胞Fig．2 E2F1 gene knockout influences the cells in the peripheral blood and bone marrow

图3 E2F1基因敲除影响髓系祖细胞及前体B细胞发育Fig．3 E2F1 knockout influences the development of myeloid progenitor and pre B cells

为了了解E2F1基因对骨髓造血干细胞的影响，我们分析了骨髓造血干细胞及长期、短期造血干细胞数及细胞周期的变化。研究发现，E2F1基因敲除后，骨髓造血干细胞、长期造血干细胞及短期造血干细胞的数量显著减少，而且处于静止期的造血干细胞比例明显降低(图4)。由此可见，E2F1基因对骨髓造血干细胞发育、分化有重要作用。

3 讨论

已有研究表明，E2F1基因缺失可以抑制小鼠胸腺细胞凋亡，从而使成熟T细胞增多、胸腺增生［9］，而关于E2F1基因缺失对造血干细胞的影响，未见相关研究。

图4 E2F1敲除影响骨髓造血干细胞数量及细胞周期Fig．4 E2F1 knockout influences the number of HSC and cell cycle

本研究应用E2F1基因敲除小鼠及同窝野生对照小鼠，应用流式细胞仪分析E2F1基因缺失对造血系统的影响。研究发现，E2F1基因缺失小鼠，外周血CD4+细胞比例增多，CD11b+细胞比例降低，骨髓中CD8+细胞比例增多，B220+细胞比例降低，可见E2F1基因缺失对造血系统中T、B淋巴细胞及髓系细胞均有重要影响(图2)。因此，本研究进一步分析了骨髓中前体B淋巴细胞的发育，结果发现，前体B淋巴细胞及未成熟B淋巴细胞比例明显降低，而成熟B淋巴细胞比例显著增高，这说明E2F1基因在B淋巴细胞发育中有重要作用(图3B)。同时，对髓系祖细胞的分析发现，E2F1基因缺失小鼠，髓系祖细胞及各单系祖细胞数明显减少，可见E2F1基因对髓系细胞的发育有重要作用(图3A)。另外，本研究发现E2F1基因敲除小鼠中造血干细胞(LSK)及长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞(STLSK)的数量都明显减少，而且处于G1期的造血干细胞显著降低，由此可见，E2F1基因对造血干细胞的细胞周期调节起重要作用(图4)。

E2F1基因对造血干细胞影响的作用机制，还需进行增殖、凋亡及相关信号通路等实验;E2F1基因敲除对造血干细胞功能的影响，尚需通过克隆形成、竞争性骨髓移植等实验进一步研究。

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