防风对六味地黄丸干预实验性视网膜变性作用的影响

梁丽娜 王志强 马 纳 马群英 李 骄 唐由之

2中国中医科学院西苑医院

内治法是中医眼科的重要治疗手段，然而眼病的发生，可因全身疾病而引起或同时伴有全身病变，亦可仅为眼部发病且始终局限在眼部。临床上一些眼病，其患者有全身症状的甚至不到50%〔1〕。虽然眼病的局部辨证日益受到重视，但目前临床上无论是依据全身辨证亦或局部辨证所用的方剂仍多与内科所用的方剂无异，如何提高全身用药后药物有效成分在眼部的靶向性作用，从而提高临床疗效是我们现代中医眼科医师面临的问题和挑战。引经药的使用，是传统中医学处方的一大特色，关于中药引经的原理，尤在泾在他的《医学读书》中说：“兵无向导则不达贼境，药无引使则不通病所”。在眼科内服方剂的引经药中，风药是最常用的。高键生研究员认为祛风药与补益肝肾药同用，有助于益精升阴，明睛地黄丸中的“防风”为风中润剂，升发引经而无燥烈伤阴之弊，当为首选〔2〕。因此，本次实验选择防风作为引经药，补益肝肾的经典方六味地黄丸做为代表方，以碘酸钠诱导的视网膜变性模型为研究对象〔3〕，采用现代研究技术，观察加入防风后对六味地黄丸干预实验性视网膜变性作用的影响，初步探讨引经药的作用。现将研究报告如下。

1 资料与方法

1.1 视网膜变性模型建立及分组

SPF级SD大鼠40只，5周龄，体重80～100 g，雄性，由北京华阜康生物科技有限公司提供。将40只大鼠按照随机数字表法随机分为4组：蒸馏水组、六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组，正常对照组，每组10只。按体重35 mg/kg盐酸氯胺酮（福建古田药业有限公司）和5 mg/kg盐酸赛拉秦（吉林华牧动物保健品有限公司）的混合液麻醉蒸馏水组、六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组大鼠后，参照文献〔3〕的方法，采用40 mg/kg碘酸钠尾静脉注射予以造模。造模后第1天开始灌胃给药，六味地黄丸组采用六味地黄丸（出处《小儿药证直诀》：熟地24 g、山萸肉12 g、山药12 g、泽泻9 g、丹皮9 g、茯苓9 g）溶液灌胃，每日灌胃1次，每次2毫升，灌胃剂量1.25 g/kg；六味地黄丸组+防风组采用六味地黄丸加防风溶液灌胃（熟地 24 g、 山萸肉 12 g、山药 12 g、泽泻 9 g、丹皮9 g、茯苓 9 g、防风 9 g）溶液灌胃，每日灌胃 1次，每次2毫升，灌胃剂量1.4 g/kg；蒸馏水组采用2毫升蒸馏水灌胃，每日1次。正常对照组大鼠不予造模，常规喂养。

1.2 视网膜病理学改变

颈椎脱臼法处死大鼠后，快速取出左眼眼球置于4%多聚甲醛固定液中15～20 min后，从角膜缘剪开眼球、小心去除眼前节和部分玻璃体，余下“眼杯”再次同定2 h左右，依次梯度酒精脱水、二甲苯透明后浸蜡包埋。连续5 μm切片，HE染色后光学显微镜观察视网膜病理改变。参照文献〔4〕的方法，根据碘酸钠所致视网膜色素上皮和外核层细胞损伤的程度制定以下评级标准：0分：视网膜结构正常；1分：视网膜色素上皮损伤，外核层排列轻度紊乱或外核层波浪状改变占视网膜全长≤1/5；2分：视网膜色素上皮损伤，外核层排列轻度紊乱或外核层波浪状改变占视网膜全长≤2/5；3分：视网膜色素上皮损伤，外核层排列轻度紊乱或外核层波浪状改变占视网膜全长≤4/5；4分：视网膜色素上皮损伤，外核层排列轻度紊乱或外核层波浪状改变占视网膜全长≥4/5。

1.3 TUNEL法检测视网膜神经细胞凋亡

颈椎脱臼法处死大鼠后，快速取出右眼眼球，于4%多聚甲醛液中4℃固定，OCT包埋后液氮冷冻。冰冻切片机CM1850（德国Leica公司）在-23℃下行垂直视网膜的8 μm冰冻切片，行TUNEL检测，具体操作参见试剂盒说明（德国Roche公司），完成后进行 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；北京博奥森生物技术有限公司）复染，抗荧光衰减封片剂（北京博奥森生物技术有限公司）封片，荧光显微镜（日本奥林帕斯公司）下观察，每组随机选取8张片子，每张片子随机选区三个视野，计数RPE凋亡细胞及RPE总数，计算凋亡率。

1.4 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件进行数据处理，病变程度计分以均数+标准差表示，多组均数比较采用方差分析；凋亡率的分析采用卡方检验。

2 结果

2.1 视网膜组织病理学观察

碘酸钠造模后，各组视网膜色素上皮层和外核层均出现病理损伤。在第7天时视网膜色素上皮细胞层的病变较外核层明显，细胞数减少，外核层出现排列紊乱和波浪状改变，与蒸馏水组相比，六味地黄丸组及六味地黄丸+防风组病变较轻，六味地黄丸+防风组外核层病变范围得分与蒸馏水组相比差异有统计学意义（P<0.05）。14天时，各组外核层细胞数目也出现减少，病变的程度和范围较7天时扩大，各组外核层病变范围差异无统计学意义。正常组大鼠视网膜及脉络膜层次分明、结构清晰、无异常（图1，图 2）。

2.2 各组凋亡情况：7天时，各组视网膜色素上皮层出现了大量的细胞凋亡，外核层未见凋亡现象。蒸馏水组、六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组病变部位的凋亡率分别为69.6%，69.2%和40%，其中六味+防风组与蒸馏水组相比差异有统计学意义（P<0.05）。14天时，各组凋亡细胞均较7天时减少，与治疗组相比蒸馏水组大鼠视网膜色素上皮层可见较多的凋亡细胞，外核层亦见散在的凋亡细胞；六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组视网膜色素上皮细胞凋亡较少，外核层未见细胞凋亡，各组细胞凋亡率分别为56.5%，40%，23.8%，六味地黄丸+防风组与蒸馏水组相比差异有统计学意义（P<0.05）。正常对照组7天及14天均未发现细胞凋亡（图3，图4）。

3 讨论

中药引经理论是中药归经理论的发展延伸，是金元时期李东垣、王好古等一代名医的理论创举。引经药在眼科的应用从《原机启微》的遣方用药可见一斑，例如在卷之下的四十张内服方剂中，每张处方中均按君、臣、佐、使组成。祁宝玉教授对上述方剂中使药的使用初步分析发现凡涉及补益脏腑、气血精液者其所用的使药即引经药多为散发升举之品；在热邪导致眼病的治疗中，使药多用苦寒清热泻火之品引经,认为治疗目疾时不在方剂中选用相应的引经药，恐难上达目窍而取效，因此在采用内治法治疗眼病时要考虑引经药的使用〔5〕。通过总结眼科常用古方发现，在眼科内服方剂的引经药中，风药是最常用的。除用于治疗外障疾病外，在治疗内障方中也多配伍风药，如《太平惠民和剂局方》之明睛地黄丸中之防风，李东垣的益阴肾气丸中的柴胡，倪维德之石解夜光丸的防风，傅仁宇之生熟地黄丸中的防风、羌活，根据中医理论眼位至高，内服方剂中伍用风药，取其升散之功,使药力直达病所而发挥治疗作用。

六味地黄丸是是滋补肝肾的经典方剂，在眼科应用也较为广泛，尤其是老年性黄斑变性、视网膜色素变性等慢性眼底病患者，虽然临床证型较为复杂，但肝肾不足是其常见证型，临床上常用六味地黄丸加减治疗。单用六味地黄丸与伍用防风后疗效是否有差异是我们本次研究的重点，动物模型我们采用碘酸钠注射诱导的方法，这是因为碘酸钠可以特异性损伤视网膜色素上皮，继而引起感光细胞的凋亡，这与视网膜色素变性和干性老年性黄斑变性的发病机制相似。结果发现单用六味地黄丸治疗视网膜病变的程度及视网膜色素上皮细胞的凋亡程度有轻度改善，但和模型组相比无明显差异，加用防风后视网膜病变的程度及RPE的凋亡程度均较模型组显著减轻，显示防风具有一定的增效作用。医家沈石匏说：“引经之药，剂中用为向导，则能接引众药，直入本经，用力寡而获效捷也”，阐释了引经药具有增加疗效的特点。关于引经药如何“引经”近年也有所探讨，目前主要有以下两种观点：一是认为引经理论与西药的载体学说有相似之处，引经药具有载体以及受体亲和力的作用，能加强局部的吸收并减弱其它部位的吸收〔6-8〕；另外一种说法是引经药物不是通过改变其它药物成分及及其含量发挥作用，而是通过改变药物作用的内环境而实现〔9-10〕。我们的实验结果初步显示防风具备引经药增效的作用特点，但其是否是通过增加六味地黄丸有效成分的析出、亦或增强血眼屏障对药物的的通透性从而增加了药物有效成分在眼部聚集的“引经”作用还有待进一步证实。

综上所述，本实验从药效学角度初步证实防风可以增强六味地黄丸对视网膜变性损伤的干预作用，我们推测防风可能具有引经药的作用，我们将在下一步的药代动力学及药理学实验进行进一步探讨验证。

[1]孔玉锋，李丰常.中医眼科微观辨证体会[J].实用中医药杂志，2006，22（8）：506.

[2]高健生.论益气升阳举陷与益精升阴敛聚治法[J].中医杂志，2004，7（15）：485-487.

[3]Enzmann V，Row BW，Yamauchi Y，et a1.Behavioral and anatomieal abnormalities in a sodium iodate-induced model of retinal pigment epithelium degeneration[J].Exp Eye Res，2006，82（3）：441-448.

[4]朱颖婷，邓新国，高杨，等.碘酸钠诱导视网膜损伤的病理改变和SOD、CAT 的变化 [J].中国病理生理杂志，2010，26（9）：1851-1854.

[5]祁宝玉，郝进.引经理论在眼科治疗中的应用[J].中国中医眼科杂志，2007，17（5）：249-251.

[6]李英伦，卢胜明，简沫，等.桔梗“引经”对罗红霉素肺药浓度的影响[J].中兽医医药杂志，2003，24（3）：3.

[7]刘启德，梁美容，陈芝喜，等.冰片对庆大霉素透血脑屏障的影响[J].广州中医学院学报，1994，11（1）：7.

[8]赵瑞芝，刘少军.中药引经理论与靶向给药[J].中医杂志，2005，16（9）：613-615.

[9]赵保胜，刘启德.冰片促血脑屏障开放与病理性开放的比较[J].中药新药与临床药理，2002，1（5）：1183-1185.

[10]杨洪滨，李志坚，于楠楠，等.冰片对血眼屏障通透性的影响[J].国际眼科学杂志，2008，8（8）：1576-1579.