集胞藻PCC6803基因ssl1690缺失突变株的构建

陈思礼，镇 慧

(中南民族大学生命科学学院，武汉430074)

藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类同源蛋白家族.藻胆蛋白在体内生物合成的最后一步为色素基团与脱辅基藻胆蛋白的连接而成.在蓝藻细胞内，藻胆蛋白的某些位点与色素基团的连接是自发的，这位点本身具有裂合酶的功能，而某些位点上藻胆色素与脱辅基藻胆蛋白的正确连接需要特异的裂合酶来催化完成.研究发现藻红蓝蛋白裂合酶PecE、PecF能够组装成异源二聚体，行使胆蛋白裂合酶的催化功能，催化藻胆蛋白β亚基153位半胱氨酸残基与藻胆色素的连接，PecE和PecF通过使藻蓝色素PCB异构化形成PVB使之与脱辅基蛋白 PecA连接［1］.Zhao经研究 首次在 鱼腥 藻PCC7120中发现了与藻蓝蛋白β亚基合成相关的类裂合酶CpeS，它能够催化β亚基Cys-153与色素基团的结合［2］.另一种特异催化藻蓝蛋白β亚基合成的蛋白CpcT也在聚球藻PCC7002中发现［3］.

采用 BLAST软件同源性搜索，在集胞藻PCC6803基因组中我们发现与cpcT具有同源性的基因ssl1690.本实验利用分子生物学手段，构建出ssl1690基因缺失体，通过观察基因缺失株的表型，预测基因功能.

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌TG1和克隆载体pBluescript SK(+)质粒为本实验室保存.集胞藻 PCC6803(Synechococcus sp.PCC6803)购于中科院水生生物研究所淡水藻种库(FACHB).PCR反应所需试剂，DNA凝胶回收试剂盒，限制性内切酶，T4DNA连接酶等均购自北京天根生化科技有限公司.

1.2 缺失体载体的构建

缺失体载体的构建是将ssl1690在基因组两侧序列克隆至pBluescript SK(+)载体中，并通过酶切、连接将抗性基因卡那霉素插入到上下游同源臂间.

基因组的提取:采用超声破碎法提取总DNA.离心收集对数期蓝藻细胞，重悬于CTAB中，利用超声波破碎细胞，再加入蛋白酶K，37℃恒温水浴1 h后，使用酚氯仿法［4］提取总DNA.

上下游同源臂的克隆:根据集胞藻PCC6803基因组信息和ssl1690的遗传图谱，设计上下游同源序列的 PCR 引物:P1、P2、P3、P4(见表1)，以提取的集胞藻PCC6803基因组为模板进行PCR扩增，扩增采用梯度PCR反应，程序为:94℃5 min预变性;94℃30 s，65～50℃(每循环降 0.5℃)1 min，72℃1 min循环30 次;94℃30 s，50℃1 min，72℃1 min 循环15次;72℃延伸10 min.扩增后回收PCR产物，用限制性内切酶消化后将其连入同样酶切过的pBluescript SK(+)质粒，构建重组质粒pBlue-L-R.将重组质粒转化到大肠杆菌TG1中，筛选阳性克隆，抽质粒后送南京金斯瑞公司测序验证.

卡那霉素抗性基因的插入:利用PCR的方法，将卡那霉素抗性基因从Pet-28a(+)质粒中获取，上下游引物为K1，K2(见表1)，回收、酶切后，连接至同样酶切处理过的 pBlue-L-R重组载体上，得到pBlue-L-kan-R重组载体.

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primers

1.3 集胞藻的自然转化

［5］，将集胞藻PCC6803培养至对数生长期时，收集集胞藻细胞，用新鲜的BG11培养基重悬，使细胞浓度约7×108，取100 μL重悬细胞于离心管中，加入重组质粒pBlue-L-kan-R的溶解液30 μL，使质粒 DNA 的终浓度不少于 50 μg/mL.将此混合液25℃温育6 h后涂布于含卡那霉素的BG11平板上，30℃连续光照下诱导转化，挑取单菌落扩大培养后鉴定.

1.4 突变株的表型观察

将突变株接种于BG11液体培养基中培养，自接种当日起，每12 h测1次活细胞生物量，并以野生型为对照，观察其生长状态.

1.5 SDS-PAGE 电泳

运用超声方法提取藻胆体［6］，进行 SDS-PAGE电泳检测，分析突变株的藻胆体表达情况.

2 实验结果

2.1 PCR扩增产物电泳图

以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板，用引物P1、P2进行PCR扩增，得到1条1001 bp的上游同源臂条带，用引物P3、P4进行PCR扩增，得到1条1001 bp的下游同源臂条带，用引物K1、K2进行PCR扩增，得到1条960 bp的卡那霉素抗性基因条带.所得片段电泳结果如图1所示.

2.2 突变株

自然转化的和野生型集胞藻PCC6803在BG11卡那霉素抗性平板上培养后，其生长情况如图2所示.由图2可见，突变型集胞藻PCC6803因含卡那霉素抗性基因，因此能在平板上生长，而野生型以及未转化成功的蓝藻藻细胞不能在抗性平板上正常生长.

图1 PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoresis identification of PCR product

图2 卡那霉素抗性平板的筛选Fig.2 Kanamycin resistance plate screening

2.3 突变株与野生株生长情况比较

在光照强度为2000 Lux，25℃连续光照下培养，藻液颜色呈黄绿色，而野生株的藻液呈深绿色:说明突变株出现了漂白现象.而在光照强度为600 Lux下连续光照培养，2种藻液均出现了漂白现象.因此推测，ssl1690基因所表达的蛋白与光合作用有关.

在正常培养条件下，定期取野生株和突变株的藻液测定OD730值绘制生长曲线见图3.如图3所示，突变型蓝藻的生长速度较野生型蓝藻慢，生长对数期延迟.在BG11培养基中，藻类主营异养生活，在光照充分的情况下，这种迟缓的生长是光合作用不能正常进行的表现，推断基因ssl1690与光合作用有关.

2.4 SDS-PAGE 电泳结果

将野生型集胞藻与突变型集胞藻按超声方法提取并分离藻胆体蛋白，并进行SDS-PAGE电泳，结果如图4所示.从图4可见，突变型的藻胆体组分有所减少，即突变型的藻胆体蛋白有部分缺失.

图3 基因缺失突变株与野生型蓝藻生长曲线比较Fig.3 Comparision of wild type growth curve with deletion mutant strain

图4 藻胆体蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.4 The SDS-PAGE of phycobiliprotein

3 讨论

为研究ssl1690基因是否与裂合酶基因cpcT功能相同或相似，通过本实验进行了初步探讨.

首先，利用PCR的方法将ssl1690基因的两侧序列克隆到pBluescript SK(+)质粒载体上，并将卡那霉素抗性基因插入到两侧序列之间，得到同源重组质粒载体(pBlue-L-kan-R).运用此方法成功构建出ssl1690同源缺失突变载体，且所得的同源重组载体较大，保证了其在转入蓝藻细胞时更易发生同源重组，产生双交换［7］，从而在一定程度上保证了基因敲除的成功性.其次，利用集胞藻PCC6803在自然条件下能较高的吸收外源DNA，将同源重组载体通过自然转化的方法得到突变株.一般而言，在对数期的蓝藻细胞更易吸收外源DNA，环状的DNA比链状DNA更易发生转化，此外，适当提高浓度或延迟DNA与藻液的混合时间也能促进转化效率的提高［6，8，9，10］.

本实验发现，所得到的集胞藻PCC6803缺失突变株出现的漂白现象，与蓝藻藻细胞的生长环境无关.研究表明，在cpcT基因缺失的突变株中藻胆蛋白的合成受阻，cpcT能催化藻胆色素与藻胆蛋白上的Cys-153结合，而此位点上藻胆素的缺失可能导致β亚基无法与α亚基正常结合，使藻胆体不能正常组装.β153生色基团在藻胆体上位于外部边缘处，其主要功能是吸收光能并把能量传递到作为终受体的 β82 为生色基团上［2，11］.本实验蓝藻细胞在表型上出现漂白现象是由于β153位上的生色基团未与脱辅基藻胆蛋白正常结合，使藻蓝蛋白不能正常装配，进一步使藻胆体的生物合成受阻所致.

针对藻胆蛋白裂合酶的研究，目前已经发现cpcT、cpeT、cpcE及cpcF等基因均有裂合酶功能，而藻蓝蛋白作为重要光合作用元件，了解并掌握其生物合成机制，为研究光合作用机制和蓝藻细胞生理打下了基础，并对蓝藻引发的水华治理有重要的指导意义.

参考文献

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