流加不同物质对大肠杆菌DB15(pAET-8)表达人表皮生长因子的影响＊

张艳军，李志敏，叶 勤

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004;2.华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

人表皮生长因子(hEGF)是含有53 个氨基酸的小分子多肽，具有刺激蛋白转运、激活胞外大分子合成和促细胞增殖等作用，在临床上具有良好的应用前景和巨大的经济价值［1］.因此，甘人宝课题组［2］构建了pAET-8 质粒，人表皮生长因子基因在phoA 启动子控制下表达.文献［3］通过优化表达期pH 和葡萄糖流加策略，使得大肠杆菌DA19(pAET-8)在基本培养基中表达hEGF 水平由8 mg·L-1提高到了78.7 mg·L-1.文献［4］在此基础上通过优化氯化钙的添加量和添加时间进一步提高了hEGF 在基本培养基中的表达水平，最高达到了228 mg·L-1.

phoA 表达系统不仅具有分泌表达系统的优点，而且是一种经济的表达系统，只需限制培养基中磷的浓度即可.作为细胞生长的必需元素，限制表达阶段磷元素的浓度必然会影响细胞的生理和代谢.例如，在大肠杆菌DB15(pAET-8)表达hEGF 过程中，hEGF 生产速率在表达阶段初期最大，表达阶段后期活菌数明显降低［4］，以活菌数为基准的hEGF 比生产速率也有所降低，以菌体干质量为基准的hEGF 比生产速率降低更加明显，同时还伴随着乙酸生成速率的提高.因此，本研究考察了表达阶段流加不同物质——磷酸盐、蛋白胨(tryptone)及酵母抽提物等对大肠杆菌DB15(pAET-8)表达人表皮生长因子的影响.

1 材料与方法

1.1 菌种

大肠杆菌DB15 为华东理工大学叶勤实验室筛选得到的耐乙酸突变株［5］.质粒pAET-8 由中国科学院上海细胞与生物化学研究所甘人宝课题组［2］构建.基因工程菌DB15(pAET-8)由叶勤实验室构建，并保存于-20 ℃的25%甘油溶液中.

1.2 培养基

所有培养基均使用去离子水配置.

1)LB 培养基 1 L 含蛋白胨(英国Oxoid 公司)10 g，酵母抽提物(Oxoid 公司)5 g，NaCl 10 g，pH 7.2.

2)M 培 养 基 1 L 含Na2HPO4·12H2O 15.12 g，KH2PO43 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.011 g，葡萄糖6 g，氯化铵1 g，10 g·L-1维生素B1溶液0.2 mL，微量元素混合液［6］0.2 mL，pH 7.0.

3)MP 培养基 为磷限制的M 培养基，1 L 中含Na2HPO4·12H2O 1.89 g，KH2PO40.375 g，其他成分与M 培养基相同.

4)补料培养基 1 L 中含葡萄糖400 g，MgSO4·7H2O 10 g.

1.3 培养方法及条件

1.3.1 种子培养

将1 mL 冷冻保存的菌种DB15(pAET-8)接入装有30 mL LB 培养基的250 mL 锥形瓶里，37 ℃，250 r·min-1摇床培养11 h.转接1 mL 一级种子液于装有70 mL M 培养基的500 mL 锥形瓶中，相同条件下培养9 h，作为表达hEGF 培养的二级种子.

1.3.2 发酵罐培养

发酵罐装入2.36 L MP 培养基，接入140 mL二级种子液.培养条件:搅拌转速为 400 r·min-1，通气量为4 L·min-1，温度为37 ℃.通气量和搅拌速率根据溶解氧(DO)进行手动调整，以保证整个培养的过程中溶解氧在20%以上.用14%氨水控制培养基的pH 值，生长期控制为7.0，表达期控制为7.8.在实验过程中及时测定发酵液中铵离子浓度，当其缺乏时手动补加100 g·L-1的氯化铵培养基.

1.4 分析方法

菌体浓度测定采用浊度法，将培养液适当稀释后测A600，按标准曲线计算菌体干质量.葡萄糖含量采用葡萄糖测定试剂盒(上海科欣生物技术研究所)测定.铵离子浓度采用Berthelot 法［7］比色测定.磷酸盐采用磷钼蓝法［8］测定.乙酸测定采用气相色谱法，仪器型号为GC112A(上海分析仪器厂)，以Chromosorb101 作为固定相.人表皮生长因子(hEGF)测定采用Schagger 等改进的分离小分子肽的tricine-tris 系统［9］分离，考马斯亮蓝染色，用图像分析系统(复日生物电泳图像分析系统，上海)和分析软件(Smart View 分析软件)进行扫描定量.

2 结果

2.1 大肠杆菌DB15(pAET-8)表达hEGF 培养过程

大肠杆菌DB15(pAET-8)表达hEGF 的培养过程［4］分为3 个时期(见图1):Ⅰ期为分批培养阶段，即从发酵开始到初糖耗完，以溶解氧跳升为结束标志;Ⅱ期为指数生长期，即初始葡萄糖耗尽后按照指数流加方式流加葡萄糖，控制菌体比生长速率在0.26 h-1，直到菌体质量浓度达到10.2 g·L-1，此时培养基中的磷含量已降低至足以诱导hEGF 的表达;Ⅲ期为表达期，添加0.22 g·L-1氯化钙，并以恒速方式(补糖速率为6.61 g·h-1)流加补料培养基，直到发酵结束.该补料分批培养过程记为FB-1，菌体质量浓度、乙酸含量、磷质量浓度、菌体含磷量和葡萄糖比消耗速率(Qs)和hEGF 产量的变化趋势如图1 所示.

图1 大肠杆菌DB15(pAET-8) 表达hEGF 的培养过程(FB-1)

在分批培养阶段(Ⅰ期)，大肠杆菌DB15(pAET-8)以0.47 h-1的最大比生长速率生长，6.88 h时初始葡萄糖耗尽，溶解氧跳升，此时乙酸含量为0.17 g·L-1.在Ⅱ期前期，残余葡萄糖含量一直为零，且无乙酸产生;但在Ⅱ期接近尾声时，磷元素已成为菌体生长的限制元素，造成乙酸积累，使得Ⅱ期结束时乙酸的质量浓度达到0.26 g·L-1.在表达阶段(Ⅲ期)，无机磷(Pi)的质量浓度维持在2 mg·L-1左右，但13.14～21.63 h时菌体质量浓度仍有明显的增加，由10.6 g·L-1增加至13.1 g·L-1.由于补料培养基中并不含有无机磷，因而，此阶段菌体质量浓度的增加是以降低菌体含磷量为代价的，其由32.3 mg·g-1降低至26.0 mg·g-1(见图1).此阶段hEGF 合成速率为12.1 mg·L-1·h-1，且没有乙酸积累.24.2 h后菌体质量浓度无明显增加，hEGF 的生产速率降低至8.9 mg·L-1·h-1，且乙酸生成速率增加.至培养结束时，hEGF 和乙酸的质量浓度分别为207 mg·L-1和0.77 g·L-1.

2.2 表达阶段流加不同物质对hEGF 表达的影响

磷元素是微生物细胞中许多含磷细胞成分，如核酸、核蛋白、磷脂、三磷酸腺苷(ATP)、辅酶的重要组成元素，在遗传代谢、生长发育、能量供应等方面都是不可缺少的.在大肠杆菌DB15(pAET-8)表达hEGF 阶段，磷元素含量一直处于限制状态，这必然会对菌体生理代谢及hEGF 表达造成影响.因此，笔者考察了表达阶段流加不同物质——磷酸盐、蛋白胨和酵母抽提物等对大肠杆菌DB15 (pAET-8)表达人表皮生长因子的影响.

2.2.1 磷酸盐

表达阶段后期菌体质量浓度不再增加时，hEGF 生产速率明显降低.因此，在表达阶段限制性流加磷酸盐，以维持菌体的生长，但保持培养液的磷限制，考察了其对hEGF 表达的影响.

培养条件与FB-1 相同.表达阶段以8.49 g·h-1恒速流加补料培养基，同时以12 mg·h-1的流速流加无机磷，记为FB-2.整个过程各指标的变化趋势见图2，并与FB-1 过程进行比较.

在野生型大肠杆菌中，phoA 编码的碱性磷酸酯酶的合成在磷过量培养基中被阻遏，而在磷限制培养基中被去阻遏.phoA 启动子的诱导与胞内磷含量无关，而由胞外无机磷的含量控制［10］.虽然在表达阶段流加了磷酸盐，但培养基中无机磷含量及表达阶段初期菌体含磷量等均与对照FB-1接近(见图2(b)).因此，流加磷酸盐并未影响phoA 表达系统启动表达hEGF.此外，在表达阶段恒速流加磷酸盐，不但增加了表达初期菌体的比生长速率，而且延长了菌体生长期，使得菌体质量浓度在27 h 后仍有明显的增加(见图2(a)).与FB-1 相比，表达期流加磷酸盐使得最终菌体质量浓度提高了31%.尽管葡萄糖比供应速率较对照提高了0.027 g·g-1·h-1，但hEGF 的表达量比对照FB-1 减少了57%，仅为90 mg·L-1.因此，在表达阶段仅仅补加磷酸盐对hEGF 的表达不但无益，反而有害.此外，在表达阶段后期流加磷酸盐也未能改善hEGF 的表达.

图2 表达阶段流加磷酸盐对hEGF 生产的影响(FB-2)

2.2.2 蛋白胨

蛋白胨中含有少量无机磷，而且在灭菌过程中部分有机磷会转化为无机磷;同时，蛋白胨还含有各种氨基酸，可以为蛋白翻译提供前体.因此，在表达期间流加蛋白胨，考察了其对hEGF 表达的影响.

培养条件与FB-1 相同.表达阶段以6.95 g·h-1恒速流加补料培养基(在26 h 时提高至10.16 g·h-1)，同时以1.23 g·h-1的速度流加蛋白胨，记为FB-3.整个过程各指标的变化趋势见图3.

灭菌后蛋白胨含有少量的磷酸盐，但整个表达阶段磷的质量浓度维持在较低水平，菌体含磷量也与对照FB-1 接近，因此并未影响phoA 表达系统的诱导表达.与对照FB-1 相比，流加蛋白胨延长了菌体生长时间，同时培养结束时菌体质量浓度提高了约23%.尽管在表达阶段流加蛋白胨可以为hEGF 合成和菌体生长提供各种氨基酸，但hEGF 表达水平和表达速率却有所降低，hEGF比生产速率则降低得更多.表达阶段后期乙酸含量略高于同期对照，与较高的葡萄糖比供应速率有关.

2.2.3 酵母抽提物

酵母抽提物不但含有无机磷和各种氨基酸，而且还含有核苷酸及微量元素，它在培养过程中起到非常重要的作用，如减少乙酸生成、增强培养基缓冲能力、促进菌体生长和外源蛋白表达等［11］.因此，在表达期间流加酵母抽提物，考察了其对hEGF 表达的影响.

图3 表达阶段流加蛋白胨对hEGF 生产的影响(FB-3)

图4 表达阶段流加酵母抽提物对hEGF 生产的影响(FB-4)

培养条件与FB-1 相同.表达阶段以6.57 g·h-1恒速流加补料培养基(在26.56 h 时提高至8.82 g·h-1)，同时以1.32 g·h-1的流速流加酵母抽提物，记为FB-4，其过程曲线见图4.

酵母抽提物灭菌后含有少量的磷酸盐，与流加磷酸盐和蛋白胨的培养过程类似，流加酵母抽提物不但增加了表达阶段初期菌体的比生长速率，而且延长了菌体生长时间，同时使得培养结束时菌体质量浓度提高了19%，但整个过程中磷酸盐质量浓度维持在较低水平，表达阶段菌体含磷量也与对照FB-1 接近，因此并未影响phoA 表达系统的诱导表达.培养结束时，hEGF 表达水平达到250 mg·L-1，明显高于在表达阶段流加磷酸盐时hEGF 的表达水平，这是因为酵母抽提物可以为菌体生长和合成hEGF 提供氨基酸和核苷酸，而在基本培养基中这些都需要由葡萄糖从头合成.在表达阶段前期，2 个过程的葡萄糖比供应速率都在0.20 g·g-1·h-1左右，hEGF 的生产速率也基本一致，但FB-4 的菌体质量浓度高于对照FB-1，而hEGF 的比生产速率低于FB-1.

对照FB-1 在24 h 左右即开始有乙酸积累，而FB-4 培养过程中乙酸含量几乎一直为零.活细胞计数表明:流加酵母抽提物使得表达期的活菌数降低较少，表明流加酵母抽提物减轻了表达hEGF 所引起的细胞代谢负荷，从而减少了乙酸的生成［11］;同时，表达阶段后期hEGF 表达速率也未有明显的降低.培养过程中补入的氨水量也有所减少，这是因为大肠杆菌在利用复合氮源作为碳源时可以释放出氨［11］，从而减少了控制pH所需的氨水.

FB-4 培养过程中几乎没有乙酸产生，表明葡萄糖可能不足，提高表达阶段葡萄糖供给速率后hEGF 表达速率无明显改善，反而造成了表达阶段后期乙酸的积累(数据未列出).

3 讨论与结论

phoA 表达系统不仅具有分泌表达系统的优点，而且是相对经济的表达系统之一，只需培养基中磷含量较低即可.但是作为细胞生长的必需元素，磷限制会影响细胞的生理和代谢.在表达阶段单独流加磷酸盐虽然增加了表达初期菌体的比生长速率，延长了菌体生长期，提高了菌体质量浓度，但是hEGF 产量却比对照组减少了57%.大肠杆菌在基本培养基中表达hEGF 时需要从头合成各种氨基酸，而过多的菌体生长会消耗部分能量和氨基酸前体，由此推测氨基酸合成可能是hEGF表达的限速步骤.在表达阶段流加蛋白胨不但可以补充无机磷，同时也可以为hEGF 合成和菌体生长提供各种氨基酸，但hEGF 表达水平和表达速率却有所降低.酵母抽提物不但含有无机磷和各种氨基酸，而且还含有核苷酸及微量元素，但是在表达阶段流加酵母抽提物也未能提高hEGF 表达水平.由此表明，氨基酸或核苷酸合成并不是hEGF 表达的限速步骤.

蛋白质的合成是一个高能耗的过程，延伸的肽链每增加一个氨基酸需消耗1 个ATP 和3 个三磷酸鸟苷(GTP)［12］，是细胞内最耗能的一个过程.此外，质粒的复制也需要一定的能量，质粒越大，拷贝数越多，所需的能量就越多［13］.因此，在过量表达外源蛋白的重组大肠杆菌中，能量供给往往受到限制［14］.在大肠杆菌DB15(pAET-8)表达hEGF 阶段，磷元素一直处于限制状态，而磷限制是非常强的解偶联剂［15］.在磷限制条件下，葡萄糖运输、三羧酸循环(TCA 循环)及呼吸链中的基因转录水平均被下调，而糖酵解途径和还原型辅酶Ⅰ(NADH)脱氢酶基因则被上调［12］.大肠杆菌在磷限制条件下蛋白质表达分析表明:sucC，sucB，gltA 和icdE 等编码的TCA 循环中的酶，以及丙酮酸脱氢酶亚基(AceF)的表达水平降低了2～4 倍;而gnd 编码的磷酸戊糖呼吸途径(PP 途径)中6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和pfkB 编码的糖酵解途径(EMP 途径)中磷酸果糖激酶-2 单体的表达水平则分别增加了4.98 和3.89 倍［16］.此外，Bacillus subtilis 在不同营养限制下的代谢流分布结果表明:与碳源或氮源限制相比，磷限制条件下的TCA 循环流量大大降低，而流向乙酸等溢流代谢物的流量则大大提高［17］.同时，大肠杆菌在磷限制条件下下调了TCA 循环和呼吸链活性［12］，从而减少了ATP 的形成.因此，提高大肠杆菌DB15(pAET-8)合成ATP 的能力或许是提高hEGF 表达的关键.

此外，合成精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天门冬酰胺、甲硫氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺及缬氨酸途径的基因转录水平在磷限制条件下被下调［15］，这在一定程度也会影响hEGF 在基本培养基中的表达.

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