正交试验法优选宫衣净酊渗漉提取工艺研究

崔东安，王学智，王旭荣，张景艳，王磊，秦哲，李建喜，杨志强

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州730050;农业部新兽药工程重点实验室，兰州730050;甘肃省中兽药工程技术研究中心，兰州730050)

宫衣净酊主要由益母草、红花、葛根和车前子等中药组成，用于奶牛胎衣不下的防治，可有效促进滞留胎衣排出，改善奶牛产后繁殖性能[1]。目前该制剂属临床中试产品，其工艺繁杂、生产周期长、有效成分转移率低。合理的提取工艺是中药生产的一个重要操作单元，直接关系到中药制剂的质量和临床应用效果[2-3]。目前，中药生产常用的提取工艺评价指标是以中药提取浸出物的收得率和某一确切成分的浸提收得率或含量为指标[4]。红花是宫衣净酊主药之一，其主要生物活性成分是以羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A，HSYA)为代表的查耳酮类化合物[5]。本研究旨在探讨乙醇体积分数、溶媒用量、渗漉速度和浸渍时间等因素对渗漉提取工艺的影响，采用 L9(34)正交设计方法，以HSYA含量和浸膏得率为指标对宫衣净酊的渗漉提取工艺进行优选。

1 材料

1.1 仪器 戴安U-3000高效液相色谱仪，美国戴安公司;Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，安捷伦科技公司;超声波清洗器KQ-250型，昆山市超声仪有限公司;SNW ultra-pure water system:力康公司;旋转蒸发仪EYELAN-1100;ME235S微量分析天平。

1.2 药品 HSYA(批号:111637-201106，含量92.5%)，中国药品生物制品检定所。益母草、红花、葛根和车前子等药材，甘肃兰州黄河药材市场。甲醇、磷酸、三乙胺和乙醇等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 试验设计 建立宫衣净酊中HSYA高效液相色谱测定方法，以HSYA含量和渗漉浸膏得率为考察指标，采用L9(34)正交实验法，选择乙醇体积分数、溶媒用量、渗漉速度和浸渍时间为考察因素，优选宫衣净酊渗漉提取工艺。

2.2 宫衣净酊中HSYA的含量测定方法研究

2.2.1 样品制备

2.2.1.1 宫衣净酊样品溶液制备:按比例称取处方下各药材粗粉(粉碎各药材并过二号筛)，按照正交设计表1进行渗漉提取，收取渗漉液，40℃减压浓缩回收乙醇，流浸膏用50%乙醇稀释至1 mL药液含0.5 g原生药材，即为正交提取样品，标记备用。

2.2.1.2 供试品溶液制备:精密量取宫衣净酊样品溶液10 mL，蒸干，残渣用25%甲醇溶解，置于10 mL量瓶中，25%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.1.3 对照品溶液制备:精密称取HSYA对照品，加25%甲醇制得每1 mL溶液中含2.26 mg HSYA的对照品贮备液，4℃冷藏备用

2.2.1.4 阴性样品溶液制备:另取不含红花药材的阴性样品溶液，按照供试品溶液制备方法制备成阴性样品溶液。

2.2.2 色谱条件及系统适应性试验 ZORBAX E-clipse Plus C18色谱柱;甲醇-0.5%磷酸(三乙胺调pH至4.0)(25:75)为流动相;检测波长为403 nm;流速为0.8 mL/min;进样量5 μL;柱温25℃。在上述色谱条件下，供试溶液中HSYA色谱峰达到基线分离，峰形对称度高，且阴性无干扰，见图1-图3。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 线性关系考察:精密量取HSYA标准贮备 液，制 备 成 0.02825、0.05650、0.11300、0.226000、0.452000和0.904000 mg/mL的浓度梯度对照品溶液。按照2.2项下色谱条件，取上述对照品溶液进行HPLC分析，以对照品溶液浓度y相对应的峰面积x进行线性回归分析，得标准曲线方程y=0.4798x-2.156，相关系数为R2=0.9997，结果表明，HSYA峰面积与浓度在0.14～4.52 μg范围内呈良好线性关系。

2.2.3.2 重复性试验:取同一批次宫衣净酊样品，按照供试品溶液制备方法同时制备6份，测定HSYA含量。结果，HSYA含量为分别为0.463、0.469、0.460、0.458、0.456、0.473、0.468 mg/mL，RSD为1.36%，表明该方法可行，重复性好。

2.2.3.3 精密度试验:取同一供试品溶液，重复进样6次，按照2.2项下色谱条件，测定其峰面积，计算RSD。结果HSYA的峰面积分别为213.5120、213.7471、214.1611、214.9575、217.4039、210.5957，RSD为1.03%，表明仪器精密度良好。

2.2.3.4 稳定性试验:取新制备的供试品溶液，于0、2、4、8、12和24 h进样1 次，记录 HSYA 峰面积。结果，HSYA峰面积分别为的RSD为1.08%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.3.5 加样回收率试验:精密量取同一批次已知含量的宫衣净酊溶液6份，每份5 mL，置10 mL量瓶中，分别加入与样品所含HSYA量相当对照品，加稀乙醇溶液至刻度，摇匀。按2.1项下方法制备供试品溶液，进行含量测定，计算加样回收率。结果见表1，平均回收率为96.89%，RSD为173%，表明本试验具有良好的回收率。

回收率=(实测值-供试品中HSYA含量)/对照品HSYA加入量×100%。

表1 加样回收率试验结果

2.3 浸膏得率测定 按照《中华人民共和国兽药典》二〇一〇年版二部附录浸出物测定法，精密量取各样品溶液20 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃ 干燥3 h，移至干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定其重量，以干燥浸膏得率计算供试样品中浸出物的含量。按下列公式计算浸膏得率，浸膏得率(%)=浸膏质量/20 mL药液相当于药材质量×100%。

2.4 正交试验结果 选用 L9(34)正交表，以HSYA含量为标示性成分和浸膏得率为评价指标，对乙醇体积分数(A)、溶媒用量(B)、渗漉速度(C)和浸渍时间(D)四个因素进行正交试验，每个因素设3个水平考察处方提取工艺，因素水平见表2。按照2.2.1项下方法制备正交提取样品，分别测定HSYA含量和浸膏得率，结果见表3和表4。HSYA含量为衡量渗漉提取工艺的主要指标，设定权重系数为0.7。浸膏得率在实际生产中具有重要意义，将浸膏得率作为次要指标，设定权重系数为0.3[6]。综合评分=70×(HSYA含量/HSYA含量max)+30×(浸膏得率/浸膏得率max)

表2 试验因素水平设计

从表3中R值的大小显示，各因素作用的主次为:乙醇体积分数、渗漉速度、浸渍时间和溶媒用量。方差分析结果表明，乙醇体积分数对渗漉提取影响较大，差异显著(P＜0.05)。以A2B3C2D2组合为优选工艺，即加入12倍量70%乙醇，浸渍24 h，以2 mL/(min·kg)进行渗漉提取。由方差分析结果知，溶媒用量对渗漉提取效果的影响不显著(P＞0.05)，考虑生产成本，确立优选提取工艺为A2B2C2D2，即加入10倍量70%乙醇，浸渍24 h，以2 mL/(min·kg)进行渗漉提取。

表3 正交试验结果

表4 正交试验综合评分方差分析结果

2.5 工艺验证试验 考察上述优选提取工艺的可靠性，按照上述优选渗漉提取工艺条件，进行了3次验证试验，HSYA含量分别为 0.472、0.499和0.463 mg/mL，RSD为 1.77%;浸膏得率分别为16.87%、17.26%和16.61%，RSD为1.93%。结果表明，优选工艺稳定、可行。

3 讨论

药典中测定红花HSYA含量采用甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)为流动相，该色谱条件下色谱峰易产生拖尾现象[7]。宫衣净酊为中药复方制剂，成分较为复杂，对HSYA含量测定干扰大。参考相关文献[8-10]，本试验以甲醇-磷酸溶液为溶剂系统，经过多次色谱条件优化试验研究，当以甲醇-0.5%磷酸溶液(25∶75)为流动相时，HSYA色谱峰达到基线分离，峰形对称度高，系统适应性试验符合要求，适用于宫衣净酊中HSYA的定量分析。该方法的建立为进行宫衣净酊制备工艺优化和质量标准研究提供了定量分析方法。

HSYA属查耳酮类化合物，遇热不稳定[11]，而渗漉提取属动态浸出方法，溶剂利用率高，有效成分浸出完全，适于热不稳定成分提取分离[2]，故本研究在保持产品原有酊剂剂型的基础上，采用了渗漉提取工艺。综合考察乙醇体积分数、溶媒用量、渗漉速度和浸渍时间四个因素对提取效果的影响，本研究优选获得了宫衣净酊的渗漉提取条件，即加入10倍量70%乙醇，浸渍24 h，以2 mL/(min·kg)进行渗漉提取。工艺验证试验结果表明该工艺稳定、可行、节约成本、有效成分浸出率高。

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