MSTN RNAi双元表达载体构建及效果试验

胡 兰，隋世慧，吴 丹

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳110866）

肌肉生成抑制素基因（myostatin，MSTN）是1997年美国的John Hopkins大学医学院的一个研究小组在研究转化生长因子－β（TGF－β）时发现的一类生长因子，被命名为生长/分化因子－8（GDF－8）。由于GDF－8是一种能够对肌肉生长起负调控作用的分泌蛋白，所以又命名为肌肉生成抑制素。McPherron研究发现，MSTN基因缺失鼠肌肉增大，骨骼肌肌群分布更广泛，体重约是野生鼠的2倍［2］。Kambadur发现，双肌牛中该基因发生突变，结果在同样喂食条件下，双肌牛比普通牛多提供30% 的肉产品，极大地提高了饲料转化效率［3］。

MSTN基因主要通过抑制成肌细胞的增殖与分化促进肌肉的生长［4］，任何能够抑制其表达的方法都会影响到动物体肌肉的生成。2002年，Lin J等建立了 MSTN基因敲除鼠模型［5］，2010年，Jain H等报道了利用RNA干扰法完成了羊成纤维细胞MSTN基因缺失模型的建立［6］。

本试验旨在根据RNA干扰基因表达的原理，构建高效抑制MSTN基因表达的RNAi双元表达载体，建立非基因水平上的 MSTN“Konck－out”模型，从而为进一步研究该基因的作用机理、有效控制畜禽肌肉生长，以及治疗肌营养不良等疾病提供重要的试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 制备鸡原代成肌细胞时取材于El4海蓝鸡鸡胚（雌雄不限），鸡胚由沈阳农业大学种鸡场提供。

1.1.2 菌株和质粒 工程菌株 DH5α、scs110、质粒pHANNIBAL、质粒pEGFP－N1均为本实验室保存产品；TA克隆载体pMD－18Tsimple vector，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 工具酶和主要试剂 Western blotting试剂盒、限制性内切酶和DNA Ladder Marker等，均购自宝生物工程（大连）有限公司；一抗为GDF－8，购自SCBT公司；二抗为HRP－兔抗羊IgG，购自北京华特生生物公司。

1.1.4 引物 引物一：上游5′－CTCGAGCTGGCAGAGTATTGATGTG－3′（引入XhoⅠ酶切位点）；

下 游 5′－GGTACCCTGGGATTTGCTTTGT－GT－3′（引入KpnⅠ酶切位点）；

引 物 二：上 游 5′－GGATCCCTGGCAGAGTATTGATGTG－3′（引入BamHⅠ酶切位点）；

下 游 5′－ATCGATCTGGGATTTGCTTTGTGT－3′（引入ClaⅠ酶切位点）。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的PCR扩增 反应条件如下：94℃预变性2min，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10min，将PCR产物分别命名为M1和M2。

1.2.2 TA克隆 PCR产物经电泳、克隆、测序，将鉴定正确的克隆命名为p－M1和p－M2。

1.2.3 目的片段的亚克隆 双酶切pHANNIBAL、p－M1和p－M2，电泳回收、酶切鉴定、连接，将已插入正向和反向目的片段的中间载体命名为pHA－M1－M2。

1.2.4 MSTN RNAi双元表达载体的构建 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pHA－M1－M2和pEGFPN1，电泳回收相应的目的片段，连接，转化，卡那抗性筛选、提取质粒，单、双酶切鉴定。

1.2.5 成肌细胞培养 常规方法培养14日龄鸭胚成肌细胞，转染1h后，再加入完全培养基至5mL/孔，继续培养48h。

1.2.6 转染细胞中MSTN蛋白表达检测 转染后48h，SDS－PAGE电泳分离蛋白，蛋白质转移到PVDF膜，30mA恒流过夜，封闭过的膜加入一抗室温孵育1.5h，加入HRP标记的二抗室温孵育1 h，经X胶片曝光显影。

2 结果与分析

2.1 MSTN RNAi双元表达载体目的片段的获得以MSTN cDNA为模版，PCR扩增产物电泳图（图1）可见清晰条带，分别命名为 M1和 M2。M1和M2克隆后经单、双酶切（图2）鉴定，序列测定结果与预期片段相符。

图1 PCR扩增产物电泳

为了获得构建MSTN RNAi双元表达载体所需的目的片段，分别利用KpnⅠ和XhoⅠ对p－M1单、双酶切，分别利用ClaⅠ和BamHⅠ对p－M2单、双酶切，电泳结果（图3）与预期完全一致。回收两个双酶切片段。

2.2 目的片段亚克隆的鉴定结果 试验中以pHANNIBAL为中间载体，将XhoⅠ/KpnⅠ双酶切回收的片段正向插入pHANNIBAL，经回收、电泳鉴定（图4）为阳性的质粒命名为pHA－M1；然后将经ClaⅠ/BamHⅠ双酶切回收的片段反向插入质粒pHA－M1，电泳鉴定（图5）为阳性的质粒命名为目的序列并命名为pHA－M1－M2。

图5 pHA－M1－M2经XhoI和BamHI的单、双切电泳图

2.3 MSTN RNAi双元表达载体pEGFP－N1－M1－M2的构建 用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切重组质粒pHA－M1－M2和表达载体pGEFP－N1，连接、转化、培养、提质粒后对重组质粒进行单、双酶切鉴定（图6），双酶切后电泳检测出现了4.7kb和1.5kb左右的两个片段，结果与设计一致。借助中间载体的几次亚克隆，成功构建了含有MSTN－RNAi表达盒的双元表达载体pEGFP－N1－M1－M2（图7）。

图6 pEGFP－N1－M1－M2 酶切鉴定电泳图

2.4 荧光蛋白的表达检测 将已构建的pEGFPN1－M1－M重组质粒转染成肌细胞，48h后，在荧光显微镜下观察发现有绿色荧光如（图8），说明成功转染。

2.5 pEGFP－N1－M1－M 对 MSTN 蛋白表达的影响 转染48h后，SDS－PAGE蛋白电泳结果（图9）显示对照组Ⅰ（空白组）和对照组Ⅱ（空载体组）在42kD处有一明显蛋白条带，而试验组在42kD处几乎看不见有蛋白条带。Western blot对成肌细胞MSTN蛋白表达结果（图10）表明，pEGFP－N1－M1－M2转染48h后，能够明显抑制成肌细胞中MSTN基因的表达。

3 讨论

本试验以TA载体为克隆载体，pHANNIBAL为中间载体，表达载体选用了pEGFP－N1－M1－M2。pHANNIBAL是含有丙酮酸磷酸激酶（PDK）内含子序列的亚克隆载体，在内含子的两侧各有一个多克隆位点，该中间载体内含子边界序列在形成发夹RNA（hpRNA）结构中十分关键，也是产生RNAi的关键所在［7］。将目的片段从TA克隆载体上切下后，以正、反两个方向插到中间载体上，经表达能够形成完整的发夹结构。该发夹结构在Dicer酶的作用下被切成长度在19～22nt的siRNA双链，siRNA双链产生后，siRNA结合到核糖核酸酶复合物上被切割成具有同源序列的基因转录体，最终导致基因沉默效应［8］。

pEGFP－N1－M1－M2转染成肌细胞48h后，可检测到绿色荧光蛋白表达，该双元表达载体可明显抑制成肌细胞MSTN基因的表达。该试验为有效抑制成肌细胞MSTN基因的表达提供了一条新的途径。但是，该双元表达载体是否对动物体其他细胞的蛋白生成有影响，如何将其应用于畜牧生产或者某些疾病的临床治疗等诸多问题还有待进一步研究。

［1］ Lee S J，Mcpherron A C.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF－beta superfamily member［J］.Nature，1997，387：83－90.

［2］ Mcpherron A C，Lee S J.Suppression of body fat accumulation in myostatin deficient mice［J］.Clin intrest，1997，109（5）：595－601.

［3］ Kambadur R，Sharma M，Smith T P，etal.Mutations in myostatin in double－muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle［J］.Genome Res，1997，7（9）：910－916.

［4］ Joulia－Ekaza D，Cabello G.Myostatin regulation of muscle development：Molecular basis，natural mutations，physiopathological aspects［J］.Experimental Cell Research，2006，312（13）：2401－2414.

［5］ Lin J，Arnold HB，Della－Fera MA，etal.Myostatin knockout in mice increases myogenesis and decreases adipogenesis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，291（3）：701－706.

［6］ Jain H，Singh S，Kadam M，etal.Knockdown of the myostatin gene by RNA interference in caprine fibroblast cells［J］.J Biotechnol，2010，145（2）：99－102.

［7］ Helterline D L，Garikipati D，Stenkamp D L，etal.Embryonic and tissue－specific regulation of myostatin－1and－2gene expression in zebrafish［J］.Gen Comp Endocrinol，2011，151（1）：90－97.

［8］ Hamada M，Ohtsuka T，Kawaida R，etal.Effects on RNA interference in gene expression（RNAi）in cuLtured mammalian cells of mismatches and the introduction of chemical modifications at the 3’－ends of siRNAs［J］.Antisense Nucleic Acid Drug Dev，2002，12：301－309.