马腺疫链球菌的分离与鉴定

陈新华，康立超，黄 新，韩猛立，何延华

（1.新疆生产建设兵团农四师七十七团，新疆 伊犁835601；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所 绵羊繁育生物技术重点实验室，新疆 石河子832000）

新疆伊犁马的主要繁育基地在昭苏马场，随着自治区大畜牧业的发展，确定了“以马产业为主导产业”的发展战略，重点发展养马业和马产品的综合产业。随着马产业的迅速发展，马腺疫又重新抬头，不仅阻碍了马驹的生长发育，还影响着马匹的美观，甚至导致死亡。2011年在昭苏马场出现马腺疫，发病率80%～100%，死亡率不高。病原分离鉴定及其16SrDNA序列分析报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料来源无菌采集6匹病马的颌下淋巴结肿胀化脓液。

1.2 试剂 普通肉汤和琼脂平板、5%绵羊鲜血平板、LB液体培养基、PBS水溶液，2xTaqPCR Master Mix、ddH20、DNA Marker DL－2 000，购自北京天根生化科技有限公司，链球菌生化鉴定试剂盒和链球菌生化编码鉴定手册，购自杭州天和微生物试剂有限公司；试验用昆明系小鼠24只，购自石河子大学实验动物中心。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分离纯化与染色镜检 将无菌采集的脓液划线接种于普通琼脂平板和绵羊鲜血平板，37℃培养48h后，挑取单菌落进行纯化培养，直到菌落形态稳定一致，保存菌种。

将脓液抹片，瑞氏染色和革兰染色，挑取单菌落和肉汤培养物进行革兰染色，在光学显微镜下观察细菌的形态特征。

1.3.2 生化鉴定 将分离菌分别接种于链球菌生化鉴定试剂盒，37℃培养24h，加入指示剂，观察结果，根据链球菌生化编码鉴定手册（GYZ－12St）鉴别分析，认定指数接近100为可靠结果。

1.3.3 动物致病性试验 挑取纯化单菌落接种含5%新生犊牛血清的LB液体培养基，37℃摇床培养48h，采用涂布法进行活菌计数，并用无菌肉汤稀释到5×108CFU/mL，试验组每种菌腹腔注射3只小鼠（0.2 mL/只），对照组3只小鼠腹腔注射无菌肉汤。隔离饲养，定时观察小鼠发病情况，死亡小鼠立即剖检，观察病变并采集小鼠心血和肝脏进行培养和镜检。

1.3.4 分离菌16SrDNA的PCR测序 （1）PCR模板的制备挑取该分离株致病菌纯培养单菌落，用50μL ddH2O涡漩震荡重悬，煮沸变性10min，12 000r/min离心2min，取上清液保存备用。（2）16SrDNA的PCR扩增细菌16SrDNA通用引物序列为 F27：5′－AGAGTTGATCCTGGCTCAG－3′，R1492：5′－AAGGAGGTGATCCAACCGCA－3′，欲扩增片段大小为1 500bp左右，上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；反应体系（20 μL）：2×TaqPCR Master Mix10μL、ddH2O 8μL、上下游引物各（10mmol/L）0.5μL、模板1μL；反应程序为95℃5min，95℃变性40s、56℃退火40s、72℃延伸1min 30s、30个循环，72℃延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。（3）测序比对分析 单一条目的条带PCR产物，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序结果通过Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在 Gen－Bank中进行比对。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养 从6匹病马分别分离到7株菌，分别命名为XJYL－M1、XJYL－M2XJYL－M3、XJYL－M4、XJYL－M5、XJYL－M6－1和 XJYL－M6－2。

脓液抹片瑞氏染色见有大量球菌，革兰染色呈阳性，弯曲的长链条。固体培养基上的分离菌形态多样，单在或成丛排列。

XJYL－M1、XJYL－M2、XJYL－M3、XJYL－M4、XJYL－M5和XJYL－M6－2在普通肉汤和平板生长不良；5%绵羊鲜血平板上发生β型溶血，露珠状小菌落周围形成完全透明的溶血带，宽度可达3mm；LB肉汤培养16h，上清液虽清亮，但摇动试管能看到管底有少量链状的菌体缠绕一起，剧烈摇动才能使肉汤混浊，继续培养后又沉到管底。

XJYL－M6－1在普通琼脂平板生长良好，5%绵羊鲜血平板上发生β型溶血，LB肉汤培养可见混浊。

2.2 生化鉴定 生化鉴定结果见表1。

判定结果：XJYL－M1、XJYL－M2、XJYL－M3、XJYL－M4和XJYL－M5鉴定结果为马链球菌（认定指数0.98，尚需鉴别）；XJYL－M6－1毗邻乏养球菌（认定指数0.98，尚需鉴别），烟草法克拉姆氏菌（认定指数0.97，尚需鉴别），溶血孪生球菌（认定指数0.90，尚需鉴别）；XJYL－M6－2为苛求颗粒链球菌（0.98，尚需鉴别），动物兽疫链球菌（认定指数0.97，尚需鉴别）。

表1 分离菌的生化鉴定

2.3 动物致病性试验 将分离菌的菌液接种小鼠后，试验组小鼠在24～48h内陆续全部死亡，取死亡小鼠肝脏和心血接种于血平板上，发生β溶血，取典型菌落涂片，革兰染色镜检，证实分离到接种菌，对照组试验鼠健活。

2.4 分离菌16SrDNA的PCR扩增分析 分离菌16srDNA PCR扩增产物，在预计大小处出现明显的目的条带（图1）。

图1 PCR扩增产物

对该株分离菌进行16SrDNA PCR测序，序列经Blast比对，结果显示，XJYL－M1、XJYL－M2、XJYL－M3、XJYL－M4和 XJYL－M5分离菌的 16S rDNA序列与马链球菌马亚种（Streptococcusequisubsp.equistrain）的同源性达100%，XJYL－M6－2的16SrDNA序列与马链球菌兽疫亚种（Streptococcusequisubsp.zooepidemicusstrain）的同源性达100%，XJYL－M6－1的16SrDNA序列与金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureussubsp.aureus strain）的同源性达100%。

3 讨论

本试验从新疆伊犁某马场暴发的马腺疫脓液中分离筛选出7株革兰阳性球菌，将分离菌株纯化培养后，经形态学鉴定、16SrDNA的克隆和序列分析，判定分离菌5株为马链球菌马亚种（Streptococcusequisubsp.equistrain）、1株为马链球菌兽疫亚种 （Streptococcusequisubsp.zooepidemicus strain）和1株金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureussubsp.aureusstrain）。经人工感染小鼠试验证明分离菌具有一定的致病性。

马腺疫是由马链球菌马亚种引起马属动物的一种急性接触性传染病。以发热、上呼吸道黏膜发炎、颌下淋巴结肿胀化脓为特征。本试验从1匹发病马上分离到马链球菌兽疫亚种和金黄色葡萄球菌。因此，马腺疫的预防和治疗不能再只针对马链球菌马亚种。

本试验细菌生化鉴定结果为马链球菌和动物兽疫链球菌等，有一定参考价值，但不能准确的鉴定此次分离菌，应该增加生化鉴定试验的种类。本试验利用PCR方法扩增16SrDNA序列，测定后，序列递交NCBI进行B1ast比对，均可获得与库中细菌序列同源性很高的菌种名称，结合生化鉴定从而可准确获得待测细菌的种属定位。

目前已得到超过2 500种的细菌16SrDNA基因序列，这使检测工作更加容易，并且还可与其他分子生物学方法相结合以提高检测效果。