日本并腹客瘿蜂共生菌Wolbachia的多重感染

杨筱慧，朱道弘，刘志伟

(1. 中南林业科技大学昆虫行为与进化生态学实验室，中国 长沙 410004；2. Department of Biological Sciences, Eastern Illinois University, Charleston, Illinois 61920, USA)

沃尔巴克氏体Wolbachia是一类与宿主胞质共生的微生物，在分类上属Proteobacteria的α亚门；其主要的宿主有节肢动物及线虫等．估计昆虫种类总数中17%～66%[1-4]感染了Wolbachia；一些昆虫种类甚至感染Wolbachia多个株系，如甲虫[5]、瘿蜂[6]、蚂蚁[7]、蝴蝶[8]、赤眼蜂[9]、果蝇[10]．Wolbachia能以诱导雄性致死(male-killing)、孤雌生殖(parthenogenesis-inducing)、宿主胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility)和雌性化(feminizing)[3]等方法控制被感染昆虫的生殖方式．基于其对宿主的特殊作用，一些学者认为Wolbach与宿主的共生、性别决定、物种形成等重要生物学问题密切相关[4]．

瘿蜂亚科分6族(tribe)，即草瘿蜂族Aylacini、豆瘿蜂族Eschatocerin、蔷薇瘿蜂Diplolepidini、槭瘿蜂族Pediaspidili、栎瘿蜂族Cynipini和客瘿蜂族Synergini[11]．除客瘿蜂族外，其他族的瘿蜂诱导寄主植物形成形态多样、结构复杂的虫瘿，为造瘿瘿蜂；客瘿蜂族本身不造瘿，而是寄居于其他造瘿瘿蜂的虫瘿内并共享造瘿瘿蜂的虫瘿组织[11]．已有的研究表明：瘿蜂有3种繁殖方式，即产雌孤雌生殖(thelyotoky)、周期性孤雌生殖(cyclical parthenogenesis)、产雄孤雌生殖(arrhenotoky)[12]．在瘿蜂亚科中，草瘿蜂族有4种、栎瘿蜂族有9种、蔷薇瘿蜂族有11种、客瘿蜂族有6种感染了Wolbachia[6, 13-15]；其中，草瘿蜂族和蔷薇瘿蜂族一些种类的产雌孤雌生殖与Wolbachia有关[14]；而栎瘿蜂族一些种类的产雌孤雌生殖与Wolbachia无关[13-15]．

为研究Wolbachia对客瘿蜂族瘿蜂感染的方式及Wolbachia对客瘿蜂族瘿蜂生殖方式的影响，作者从湖南长沙采集向川安瘿蜂Andricusmukaigawae和麦氏安瘿蜂Andricusmairei虫瘿，在这两种虫瘿中，都获得了客瘿蜂族的日本并腹客瘿蜂Synergusjaponicus．作者以日本并腹客瘿蜂Synergusjaponicus为材料，使用Wolbachia的wsp基因特异引物，利用PCR法扩增日本并腹客瘿蜂中Wolbachia的wsp基因的特异片段，以证实日本并腹客瘿蜂Wolbachia的多重感染，在此基础上讨论多重感染的Wolbachia对日本并腹客瘿蜂生殖方式的影响．

1 材料、方法

1.1 样本采集和计算公式

2010年9月至2011年5月从湖南长沙暮云镇(N27°51′，′E112°55′)和路口镇范林乡(N28°23′，E113°17′)采集向川安瘿蜂和麦氏安瘿蜂虫瘿，分别置于室温条件下的养虫笼内让其成虫羽化．在2种瘿蜂虫瘿中均获得了日本并腹客瘿蜂的羽化成虫，获得的样本以无水乙醇浸泡，于-40 ℃冰柜保存．向川安瘿蜂和麦氏安瘿蜂的寄主植物分别为白栎QuercusfabriHance和短柄枹栎Quercusglanduliferavar.brevipetiolataNakai．

性比计算公式：性比=雌性样本量/ 样本总量×100%.

1.2 样本总DNA提取和DNA模板质量的检测

从向川安瘿蜂和麦氏安瘿蜂虫瘿中所获日本并腹客瘿蜂中各取10个雌成虫，样本总DNA提取参照Zhu等[14]的方法．DNA模板质量根据Folmer方法，使用节肢动物COI特异引物LCO1490和HCO2198，对每个样本进行PCR扩增[16]来进行检测；获得的COI-PCR产物大小约为660 bp，检测结果为阳性的模板DNA用于Wolbachia检测．

1.3 日本并腹客瘿蜂Wolbachia的wsp基因检测和测序

日本并腹客瘿蜂Wolbachia的wsp基因片段的PCR扩增使用特异引物为wspF和wspR[17]，wsp-PCR的反应体系和反应条件参考Zhu等[14]的方法．PCR反应的阳性对照和阴性对照分别为已知感染的栗瘿蜂Dryocosmuskuriphilus的Wolbachia株系和纯净水．分别随机选3个Wolbachia的wsp-PCR产物，交由上海英俊生物有限公司直接双向测序．

1.4 日本并腹客瘿蜂Wolbachia的wsp基因的序列分析和系统发生树构建

以DNAsp version 4.10.2软件分析Wolbachia的wsp基因G+C含量、遗传多样性(Pi)和变异位点数目(VI)．从GenBank下载其他瘿蜂和昆虫感染的Wolbachia株系的wsp序列，使用Clustal X 2.0软件将本研究获得的阿氏客瘿蜂Wolbachia的wsp序列与下载的相应序列排列对齐；排列对齐的wsp序列长度分别为595 bp．通过Model-Test 3.7[18]软件筛选wsp基因的进化模型，其最优进化模型为GTR + G．通过MEGA 5.0[19]软件，根据GTR + G模型设定Gamma参数，计算Kimura 2-parameter遗传距离，使用邻位相连法 (neighbor-joining method) 构建NJ系统树；自导复制值为1 000次．外群为显棒赤眼蜂Trichogrammasemblidis的Wolbachia株系的wsp序列．

2 结果

2.1 日本并腹客瘿蜂的性比和Wolbaciha感染率

从向川安瘿蜂虫瘿中获日本并腹客瘿蜂共92只，其雌性率为80.4%；其Wolbachia的感染率为60%．从麦氏安瘿蜂虫瘿中获日本并腹客瘿蜂共48只，其雌性率为77.1%；其Wolbachia的感染率为35% (表1)．

表1 虫瘿的采集信息、日本并腹客瘿蜂的雌雄性比和Wolbachia的感染率

§为PCR检测昆虫数．

2.2 日本并腹客瘿蜂Wolbachia的wsp序列的分子特征和系统发生树

从向川安瘿蜂获得的日本并腹客瘿蜂感染了Wolbachia的Wmuk株系，而从麦氏安瘿蜂虫瘿获得的日本并腹客瘿蜂感染了Wolbachia的Wmai株系．Wmuk和Wmai株系的wsp-PCR产物的碱基长度分别为536 bp和539 bp，已向Genbank提交序列，其序列登录号分别为KC130969和KF040477；经Genbank的Blast工具比较,二者的碱基序列的一致性仅为77%，序列差异大．Wsp基因碱基平均G+C含量为37.2%，核苷酸的多样性为0.236，变异位点数为125，占总碱基数的22.9%．

以日本并腹客瘿蜂的Wolbachia的Wmuk、Wmai和其他瘿蜂的Wolbachia的wsp序列构建分子系统发生树(图1)．图中分支间的数字指基于1 000次自导复制的bootstrap值；黑体字指瘿蜂种类．从分子系统发生树可以看出：日本并腹客瘿蜂的Wolbachia的Wmuk和Wmai株系同属A群；W1株系和麦氏安瘿蜂及地中海粉螟感染的Wolbachia株系聚为一分支，W2株系独立为一分支．

图1 日本并腹客瘿蜂和其他瘿蜂Wolbachia的wsp序列的系统发生关系Fig.1 Phylogenetic relationship of wsp gene sequences of Wolbachia in S. japonicus and other gall wasps

3 讨论

瘿蜂亚科已知约1 400余种，于菊科、壳斗科等寄主植物上形成虫瘿，影响植物正常生长，如栗瘿蜂严重危害板栗等植物，是重要森林害虫[12]．Wolbachia能调控宿主昆虫的生殖模式，可用于害虫的生物防治．本研究中，作者使用Wolbachia的wsp基因的特异引物，通过PCR确认，不同虫瘿的日本并腹客瘿蜂种群均有Wolbachia感染，感染率为35%～60%．从向川安瘿蜂和麦氏安瘿蜂虫瘿获得的日本并腹客瘿蜂均有雌、雄，且未见性别的明显偏离，因此其生殖方式应为有性生殖.所以，作者推测Wolbachia并未诱导阿氏客瘿蜂进行孤雌生殖，但应在后续研究中对阿氏客瘿蜂进行抗生素处理来消除Wolbachia，并观察阿氏客瘿蜂性比变化才能确认该结论．

不同虫瘿的日本并腹客瘿蜂种群Wolbachia的wsp序列一致性仅77%，差异较大，显然属于不同的Walbachia株系．Wolbachia的传播方式主要为种内的垂直传播，即母代感染的细菌经卵细胞的细胞质传播至子代，但也存在种间或种内的水平传播现象[1]．如Rokas等发现3种客瘿蜂S.reinhardi，S.diaphanus，S.umbraculus与栎瘿蜂族的1种造瘿蜂A.solitarius(strain 3)；1种客瘿蜂S.crassicornis与栎瘿蜂族的2种造瘿蜂A.solitarius(strain 1)、Neuroterusmacropterus，Wolbachia的wsp基因序列完全一致，认为是Wolbachia在客瘿蜂和造瘿瘿蜂间水平转播的结果[6]．日本并腹客瘿蜂的向川安瘿蜂、麦氏安瘿蜂种群的不同株系显然不是种内垂直传播的结果，其中之一或二者可能来源于种间的水平传播．

同一宿主感染不同株系Wolbachia，即为Wolbachia的多重感染；果蝇Drosophilasimulans[4]的研究表明，在这种情况下，宿主交配时会出现胞质不相容，并产生生殖隔离．Wolbachia的多重感染是否也会诱导阿氏客瘿蜂的不同个体或种群间的胞质不相容，并产生生殖隔离?这有待进一步研究．

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