微波法辅助提取红腺忍冬花绿原酸*

舒孝顺，卿婉华，许凯扬，刘瑞兴，陶钧，龚福春

(长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南长沙，410004)

目前，提取金银花及山银花中绿原酸采用的方法［5－6］很多，本研究借助于微波提取技术具有快速简便、高效、不易破坏天然活性成分等优点，选择乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数、溶剂pH值5个因素进行单因素试验，然后筛选4个因素进行正交L9(34)试验，以确定红腺忍冬花绿原酸微波醇提的适宜工艺条件。

1 实验仪器与药品

1.1 材料及其预处理

红腺忍冬山银花，购自长沙高桥药材市场，经笔者鉴定、核实为红腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.。将从药材店购买的红腺忍冬山银花，于60℃ 烘箱中烘至恒重。用粉碎机粉碎，并过40目筛。放置干燥环境中保存备用。

1.2 仪器

UV-2550紫外/可见光分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，FA-1104型电子分析天平(上海精胜科学仪器有限公司)，LD-06A型300 g装高速中药粉碎机(上海科达医学仪器设备有限公司)，电热恒温水浴锅(京泰克仪器有限公司)，MAS-II微波辐射萃取仪(上海新仪微波化学科技有限公司)。

1.3 试剂

对照品绿原酸(批号110754)为中国药品生物制品检定所提供;95%工业乙醇，HCl、乙醇等试剂均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 绿原酸标准曲线的制备［7］

精密称取绿原酸对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加体积分数70%乙醇适量，使其完全溶解并稀释至刻度。然后用移液管吸取7.5 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，加70%乙醇至刻度线，制成15 mg/L的标准溶液，置于冰箱中避光保存。精密量取对照品标准溶液 1、2、3、5、7、9、10 mL，分别用体积分数 60%乙醇定容至10mL容量瓶，摇匀，其浓度分别为1.5、3.0、4.5、7.5、10.5、13.5 和15 mg/L。以60%乙醇作参比液，在329.9 nm处测定其吸光度，以标准品质量浓度c(μg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归得绿原酸质量浓度c和吸光度A的关系为:A=0.062 6C－0.006 5，R=0.999 8。

2.2 红腺忍冬花绿原酸的提取

准确称5.000 0 g红腺忍冬山银花粉末置于200 mL三角烧瓶中，再加一定体积和pH值的水溶液，在一定微波功率下提取4 min，提取2次，过滤，合并2次滤液，冷却后，滤液用无水乙醇调到乙醇浓度60%并定容至100 mL。

2.3 绿原酸的含量测定

精密量取微波辅助提取液1 mL，按照2.1的方法测定其吸光度值，根据标准曲线计算红腺忍冬山银花绿原酸含量及提取率。提取率计算公式如下:

《饥饿艺术家》更像是关于拯救的一个恰如其分的喻体。饥饿艺术家把自己像一只动物一样关在笼子里不吃不喝，以这种自虐展览作为自己的饥饿艺术。刚开始，好奇的人们还像举行盛大仪式那样围在他笼子前观看。很快，热情褪去的人们就开始对他熟视无睹，没有几个人愿意在他的笼子前停留；即使是专门为他饥饿艺术记数的工作人员都忘记了他的存在，直到他死去了才被人发现。

2.4 红腺忍冬山银花中绿原酸提取的单因素及正交实验

选取微波功率、提取时间、提取次数、料液比和溶剂pH值为考察因素，分别以其中一个因素为变量，固定其他因素，考察不同因素的不同水平对绿原酸含量的影响，在单因素考察的基础上，选择其中4个因素为考察因素，每个因素选择3个水平，确立因素水平表，见表1，以绿原酸含量为指标，采用L9(34)正交实验表安排实验。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 微波功率对提取率的影响

准确称取5份(5.000 0 g)红腺忍冬山银花粉末分别置于200 mL三角烧瓶中，再各加pH 3水溶液50 mL(药材体积10倍)，分别在微波功率为200、300、400、500、600 W 提取 4 min，提取 2 次，过滤，合并2次滤液，冷却后，滤液用无水乙醇调到乙醇浓度60%并定容至100 mL，测吸光度并计算提取率，结果见图1。

图1 微波功率对提取率的影响Fig.1 Effect of alcohol concentration on Extraction rate

由图1可以看出，当微波功率低于为400W时，绿原酸的提取率随着微波功率的升高而显著增大，当微波功率达到400W时达到最大值，提取率达到最大值4.32%，增大微波功率能快速提高浸提液的温度，有利于绿原酸的溶解和扩散到溶剂中;但如果微波功率过大，则会导致绿原酸的结构在较长时间的高温条件下出现降解，因此，选定300、400和500 W作为正交实验中微波功率的3个水平。

2.1.2 溶剂体积(药材重量倍数)对提取率的影响

准确称取5份(5.000 0 g)红腺忍冬山银花粉末分别置于200 mL三角烧瓶中，再各加8、10、12、14、16倍药财体积pH 3的水溶液，分别在微波功率为400 W提取4 min，提取2次，过滤，合并2次滤液，冷却后，滤液用无水乙醇调到乙醇浓度60%并定容至100 mL，测吸光度并计算提取率，结果见图2。

图2 料液比对提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate

由图2可以看出当溶剂体积倍数达到12倍时，提取率达到最大值4.45%，之后随着溶液体积的增大，提取率增加量少且缓慢，若再提高料液比会给后续浓缩工序带来困难，所以从经济方面考虑，故选择料液比1∶12为后续实验固定值。

2.1.3 溶剂pH值对提取率的影响

准确称取5份(5.000 0 g)红腺忍冬山银花粉末置于5个200 mL三角烧瓶中，再分别加12倍药材体积 pH 为2、3、4、5、6 的水溶液，在微波功率为 400 W提取4 min，提取2次，过滤，合并2次滤液，冷却后，滤液用无水乙醇调到乙醇体积分数60%并定容至100 mL，测吸光度并计算提取率，结果见图3。

由图3可以看出，开始时随着溶剂pH的不断提高，绿原酸的提取率也跟着上升，在pH 4时达到最高点，提取率达到最大值4.49%，之后随pH值提高提取率反而下降，可能由于绿原酸在酸性环境中能稳定存在，而在较高pH时变得不稳定而引起降解，因此，选定3、4和5作为正交实验中pH值的3个水平。

2.1.4 提取时间对提取率的影响

图3 溶剂PH对提取率的影响Fig.3 Effect of solvent pH on extraction rate

准确称取5份(5.000 0 g)红腺忍冬山银花粉末置于5个200 mL三角烧瓶中，各加60 mL pH值为4的水溶液，在微波功率为400 W下分别提取2、3、4、5、6 min，提取2次，过滤，合并2次滤液，冷却后，无水乙醇调到乙醇浓度60%并定容至100 mL，测吸光度并计算提取率，结果见图4。

图4 提取时间对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

由图4可以看出，在2～5 min内，绿原酸提取率随时间增加不断增长，在5 min基本上达到最大值，提取率达到4.46%，之后此时绿原酸基本上已提取，由于绿原酸对温度敏感，长时间在较高温度不稳定易降解，同时从生产周期方面考虑，因此，选定3、4和5 min作为正交实验中提取时间的3个水平。

2.1.5 提取次数对提取率的影响

准确称取5份(5.000 0 g)红腺忍冬山银花粉末置于5个200 mL三角烧瓶中，各加60 mL pH值为4的水溶液，在微波功率为400 W下，分别提取1、2、3、4、5次，每次提取4 min，过滤，合并两次滤液，冷却后滤液用无水乙醇调到乙醇浓度60%并定容至100 mL，测吸光度并计算提取率，结果见图5。

由图5可以比较得出，当提取次数为2次时，提取率基本上达到一个最大值，提取率达到4.51%，之后，因此随着提取次数增加提取率增加不大，因此我们选定1、2和3次作为正交实验中提取次数的3个水平。

2.2 正交实验

图5 提取次数对提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate

在单因素试验结果的基础上，选择微波功率、提取时间、溶剂pH和提取次数4个因素，以绿原酸提取率为评价指标，设计正交试验。试验因素水平见表1，试验设计及结果见表2。

表1 因数水平表Table 1 Factor standard

表2 绿原酸提取正交实验表Table 2 Orthographic experiment result L9(34)

由表2可知，影响微波辅助提取红腺忍冬花中绿原酸的主次因素是:微波功率＞提取次数＞溶剂PH＞提取时间，最佳工艺条件为A2B3C1D2，即微波功率400 W、溶剂pH3、提取时间5 min、提取2次，在此最佳条件下红腺忍冬花中绿原酸的提取率高达4.54%。

2.3 验证实验

精密称取5.000 g红腺忍冬花粉末3份，按最佳提取方案A2B3C1D2进行验证实验，测定绿原酸含量，结果3份样品的绿原酸含量平均值为4.48%，RSD为O.54%，与正交实验中提取率最高的工艺A2B3C1D2的含量4.57%相比，提取率较为接近。表明该提取工艺稳定、合理，方案可行。

3 结论

本实验以红腺忍冬花为原料，以水为提取溶剂，采用微波辅助萃取，在单因素试验基础上，通过正交试验对工艺进行优化，红腺忍冬花中绿原酸的微波提取最佳工艺条件为A2B3C1D2，微波功率400 W、溶剂pH3、提取时间5 min、提取2次，在最佳提取条件下，绿原酸提取率高达4.54%，该工艺较为稳定、合理、可行性较高，适合于红腺忍冬花绿原酸的工业生产。

本实验利用微波提取方法，可以极大地缩短提取时间，且能达到较高的提取效率。与传统加热提取及超声波提取法相比，微波辅助提取具有极大地缩短提取时间，而且耗能低、提取率较高的优点。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:28.

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［6］林云良，孙庆雷，祝贺.超声法提取金银花中绿原酸工艺参数优化研究［J］.山东科学，2008，21(1):26－28.

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