主成分及聚类分析用于洽洽香瓜子的快速鉴别*

朱萌萌，沈旭，陈江琳，杨婷婷，侯如燕

1(安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥，230036)2(合肥洽洽食品有限责任公司，安徽合肥，230036)

向日葵(Helianthus annulus L.)，菊科(Compositae)植物，为一年生草本，原产自美洲。在我国西北5省及内蒙古、山西等地大量种植，成为重要的油料作物［1］。葵瓜子仁含油脂28% ～32%，其中亚油酸含量高达65% ～74%，近代医学证明，亚油酸有助于人体发育和生理调节［2］，此外，葵瓜子还富含蛋白质、绿原酸、VE等［3］。葵瓜子是中国传统的休闲食品之一，其生产工艺也从传统的炒制工艺向煮制与炒制结合工艺演变［4］，“煮制”葵瓜子在加工过程中加入不同种类适量的香辛料，经百煮、炒干工艺形成了煮制香瓜子特有的香气和口感。对挥发性油的提取方法主要有溶剂萃取法、固相微萃取法、超临界CO2萃取法和同时蒸馏萃取法，而同时蒸馏萃取法因将水蒸气蒸馏萃取和溶剂萃取法合二为一，缩短了分析时间，节省萃取溶剂［5］，在中草药等材料挥发油萃取中使用广泛。目前市场上葵瓜子品牌众多，不同品牌的煮制香瓜子所呈现出的香气组分也不相同。采用感官审评去区分不同品牌的香瓜子，受评价人员的主观影响较大。近年来，数理统计方法如主成分分析、聚类分析、因子分析等方法在样品质量控制、原料鉴别、产地鉴定等方面应用广泛并取得一定成果［6－12］，而未见采用化学聚类的方法区分不同品牌香瓜子的研究报道。

本文拟采用同时蒸馏萃取装置萃取(SDE，simultaneous distillation and extraction)，气相色谱-质谱联用方法(GC-MS)分析香瓜子中的呈香组份的组成，并利用主成分聚类分析方法，旨在探索利用香瓜子挥发性成分对不同品牌的香瓜子进行化学鉴别的可行性。

1 实验材料、仪器和试剂

1.1 实验材料和试剂

洽洽香瓜子样品，由洽洽食品股份有限公司提供，其他品牌香瓜子，均购于合肥市各大超市(见表1);香瓜子样品处理(自动脱壳机脱壳后分离出仁，待检测)。

无水乙醚(分析纯);无水硫酸钠(550℃，5 h活化处理);实验室用水均为二次水。

表1 不同品牌香瓜子Table 1 The different brands of aroma sunflower seeds

1.2 内标溶液的配置

癸酸乙酯(99.99%)作为内标，用无水乙醚做溶剂。准确移取10 μL内标定容到10 mL容量瓶中，配成1 000 μg/mL 工作液。稀释至100 μg/mL，放置于4℃冰箱保存。

1.3 仪器

气相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司7890A-5975C气质联用仪，配G4513自动进样器、7697A静态顶空进样器、MSDChemstation工作站);同时蒸馏萃取装置SDE(中国科技大学玻璃仪器厂定制);DC-12氮吹仪(上海安谱科学仪器有限公司)，自动脱壳机(锦州俏牌实业有限公司)。

2 实验方法

2.1 挥发性香气组分的提取

采用SDE法提取葵瓜子挥发性香气组分:准确称取香瓜子样品20.0 g，放入1 000 mL圆底烧瓶中，加入癸酸乙酯(100 μg/mL 1 mL，内标)和400 mL纯水，将该烧瓶接入SDE装置的一个接口，另一接口与装有40 mL无水乙醚的三角锥形瓶相连。100℃同时蒸馏萃取2 h。萃取物转移至10 g无水硫酸钠的具塞试管中，静置干燥12 h。氮吹至1 mL，得到样品瓜子的精油，待进样。

2.2 色谱柱及程序升温条件

色谱柱Agilent:HP-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样量 1 μL;分流比 10∶1;进样口温度:250℃;载气为高纯度氦气(He:99.999%);流速1 mL/min;2种方法采用相同的程序升温条件:起始温度60℃，保持1 min，以5℃/min升至100℃，保持1 min，再以2℃/min升至200℃，保持1 min，最后以10℃/min，升至250℃，保持7 min。

2.3 质谱条件

电子轰击(electron impact，EI)离子源;电子能量70 eV;离子源温度200℃;四级杆温度:280℃;质量扫描范围:40～400 amu。扫描方式:全扫描;溶剂延迟3 min。

3 结果与分析

3.1 瓜子精油的分离鉴定结果

瓜子精油经气相色谱程序升温分离，四级杆质谱采集样品的总离子流图(见图1)，根据各色谱峰相应的质谱图经计算机谱库检索(取匹配度大于85的鉴定结果)并与相关文献资料比对解析确定其组成成分的化学组成(见表1)。共分离鉴定出129种挥发性化合物，其中洽洽香瓜子共分离鉴定出79种挥发性化合物，阿里山牌香瓜子共分离鉴定出67种挥发性化合物，真心牌香瓜子共分离鉴定出69种挥发性化合物，天喔牌香瓜子共分离鉴定出69种挥发性化合物，恒康牌香瓜子共分离鉴定出46种挥发性化合物，来伊份牌香瓜子共分离鉴定出63种挥发性化合物，口水娃牌香瓜子共分离鉴定出53种挥发性成分。按化合物的结构对分离鉴定出的这些化合物进行分类总结，主要分为醛类、酮类、酯类、烯烃类、醚类、含硫含氮类、酚类、醇类和酸类化合物(见图2)。洽洽、真心和口水娃香瓜子以酚类化合物为主，相对峰面积百分比含量分别为:30.91%、47.47%和27.29%;阿里山和恒康以醛类化合物为主，相对峰面积百分比为25.21%、39.84%;天喔、来伊份香瓜子以醚类和醛类化合物为主，相对峰面积百分比分别是24.63% ～34.40%、25.68%～17.23%。洽洽香瓜子中发现而其它品牌香瓜子中未发现的挥发性化合物主要有2-甲基-2-戊烯醛、2-甲基吡咯、α-环己烯酮等13种。

3.2 主成分分析

仅依据上述化合物种类和相对含量判别不同品牌香瓜子之间的区别，只能从大量的数据中抽出具有显著特征的成分进行分析，具有一定的主观性。而利用统计学主成分分析方法，可以客观的对大量数据进行分析归类。主成分分析(principal component analysis)也称主分量分析，是由霍特林(Hotelling)于1933年首先提出的，它是利用降维的思想，在损失很少信息的前提下把多个指标转化为几个综合指标的多元统计方法，从而更容易抓住主要矛盾，揭示事物内部变量之间的规律性，同时使问题得到简化，提高分析效率［13－15］。本试验以洽洽香瓜子车间不同工艺的8个样品和商售其他品牌的香瓜子挥发性成分构成14×131的矩阵，利用SPSS19.0软件进行主成分分析。主成分分析结果见表2。第一个主成分的特征根是36.083，解释了总变异的29.820%;第二个主成分的特征根是18.847，解释了总变异的15.576%。根据主成分个数确定原则，累积方差贡献率在90%以上，特征值大于1的2个原则。前8个主成分的累积方差贡献率达到92.437%，基本保留原来变量的信息。故取前8个成分作为研究的主成分进行不同品牌香瓜子进行区分是可行的。

3.3 系统聚类分析

聚类分析作［11］为一种无管理模式的识别方法，所得结果很大程度上取决于方法所采用的距离、类间距等参数。在主成分分析的基础上引入聚类分析，可排除众多化学信息中相互重叠的部分而又不丢失原始数据信息［16］。对从洽洽香瓜子和其它品牌香瓜子中分离鉴定出的131种挥发性化合物先进行主成分分析，将得到的累积方差贡献率大于90%的前8种主成分作为新的变量，采用组间连接法和欧氏距离平方的度量标准再进行聚类分析。得到聚类分析的树状图(见图2)。可以看出，取类间距离d=15时，不同工艺生产的洽洽香瓜子聚为一类，真心牌香瓜子样品单独聚为一类，恒康牌香瓜子样品单独聚为一类，阿里山牌和来伊份牌香瓜子样品聚为一类，天喔牌和口水娃牌香瓜子样品聚为一类。本实验表明，采用香瓜子挥发性成分的聚类分析，可以用于不同品牌香瓜子风味物质的表征和识别。

图1 洽洽香瓜子和其它品牌香瓜子总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of Qiaqia and the other brands of aroma sunflower seeds

图2 不同品牌香瓜子挥发性成分分类Fig.2 The classification of the volatile components from different brands of aroma sunflower seeds

表2 洽洽与其它品牌香瓜子相关矩阵的特征值Table 2 Characteristic value of correlation matrix of Qiaqia and the other brands aroma sunflower seeds

图2 不同品牌香瓜子聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram of cluster analysis of different brands aroma sunflower seeds

以14个样品的第一主成分做横坐标，以第二主成分做纵坐标，利用SPSS软件做散点图(见图3)，可以直观、简便的显示出G1-8香瓜子(即洽洽香瓜子)与其它品牌香瓜子不同，它们的品质接近，在散点图上聚在一起。

4 结论与讨论

图3 不同品牌香瓜子第1、2主成分散点图Fig.3 The scatter plot based on first and second primary components of different brands of aroma sunflower seeds

本文采用SDE法萃取并结合GC-MS联用技术分离鉴定了洽洽香瓜子及不同品牌香瓜子的挥发性香气成分，共分离鉴定出129种挥发性化合物，共包含了醛类、酚类、酮类、醚类、酯类、醇类、酸类、烯烃类和含硫含氮类化合物。不同品牌香瓜子由于加工工艺和添加香辛料种类的不同，葵瓜子中含有的挥发性化合物也不尽相同。洽洽、真心和口水娃香瓜子以酚类化合物为主，相对峰面积百分比含量分别为:30.91%、47.47%和27.29%;阿里山和恒康以醛类化合物为主，相对峰面积百分比为25.21%、39.84%;天喔、来伊份香瓜子以醚类和醛类化合物为主，相对峰面积百分比分别是24.63% ～34.40%、25.68%～17.23%。不同的挥发性香气成分在一定程度上反映了不同品牌香瓜子独特的香气类型。

采用主成分聚类分析和散点图方法，将洽洽香瓜子与其他品牌香瓜子区分开，具有直观、简便的特点，解决了依靠技术人员感官审评主观区分判断的主观性。说明将挥发性香气组分结合主成分聚类分析的多元统计方法，对香瓜子产品进行分类更为科学合理，能反映出不同品牌煮制香瓜子添加香辛料种类和加工工艺的不同，各自表现出的香气也各不相同。为香瓜子加工工艺的改进和不同品牌香瓜子的区分提供一定的理论依据和参考价值。

表3 不同工艺洽洽香瓜子和不同品牌香瓜子挥发性香气成分(n=3)Table 3 The volatility aroma components of different crafts of Qiaqia and the other brands aroma sunflower seeds(n=3)

续表3

续表3

续表3

［1］李长年，油料作物(上编)—中国农学遗产选集［M］.北京:农业出版社，1960:6.

［2］侯冬岩，回瑞华，李铁纯，等.粟米油中脂肪酸及其主成分亚油酸的分析［J］.食品科学，2010，31(22):391－393.

［3］赵华锋.原香味葵瓜子贮存中酸败机制及控制技术研究［D］，合肥:合肥工业大学，2007:1－2.

［4］沈坤.与众不同的洽洽瓜子［J］，市场营销案例，2008，2.

［5］李桂花，何巧红，杨君.一种提取复杂物质中易挥发组分的有效方法－同时蒸馏萃取及其应用［J］.理化检验:化学分册，2009，45(4):491－496.

［6］黄世杰等，主成分分析法在烟用香精质量控制中的应用［J］，烟草化学，2009，8:31－34.

［7］Sugaya N，Nakagawa T，Sakurai K，et al.Analysis of aldehydes in water by head space-GC/MS［J］.Journal of Health Science，2001，47(1):21－27.

［8］吴景社，康绍忠，王景雷，等.基于主成分分析和模糊聚类方法的全国节水灌溉分区研究［J］.农业工程学报，2004，20(4):64－68.

［9］谭丽贤，挥发性成分聚类分析在酱油鉴别中的应用［J］，中国食品添加剂，2012(4):201－206.

［10］周玲，乌龙茶香气挥发性成分及感官性质分析［D］，重庆:西南大学，2006，5.

［11］宋江峰，李大婧，刘春泉，等.甜糯玉米软罐头主要挥发性物质主成分分析和聚类分析［J］.中国农业科学，2010，43(10):2 122－2 131.

［12］何晓群，多元统计分析［M］.北京:中国人民大学出版社，2004.

［13］岳田利，彭帮柱，袁亚宏，等.基于主成分分析法的苹果酒香气质量评价模型的构建［J.农业工程学报，2007，23(6):223－227.

［14］戴素贤，谢赤军，陈栋等.七种高香型乌龙茶香气成分的主成分分析［J］，华南农业大学学报1999，20(1):113－117.

［15］Wang L，Xu Y，Zhao G，et al.Rapid analysis of flavour volatile in apple wine headspace solid-phase microextration［J］.Journal of Institute of Brewing，2001，110(1):57－65

［16］石杰，李长滨，吴拥军，等.不同厂家冬凌草片的近红外光谱主成分聚类分析［J］，郑州大学学报2011，43(4):67－70.