超声波辅助提取中华苦荬菜多酚工艺优化及不同干燥方式对其得率的影响*

石同同，陈莹莹，王颉，孙剑锋，郑乾魏

1(河北农业大学食品科技学院，河北 保定，071000)2(河北农业大学园艺学院，河北保定，071000)

中华苦荬菜(Ixeris chinensis(Thunb.ex Thunb.)Nakai)含有丰富的营养成分和生理活性物质，具有较高的营养价值和保健作用，也是一种药食共用的植物［1］。中华苦荬菜在我国分布广泛，野生资源丰富，食用、药用历史悠久，其化学成分及药理作用复杂［2－3］。多酚类物质是一族在结构中含有酚的化合物，属于植物的次生代谢产物［4］，有研究报道，植物多酚具有清除体内自由基、抗凝血、抗炎、防癌以及预防心血管疾病等多种作用。中华苦荬菜中所含成分十分复杂，常用提取多酚的方法有煎煮法、回流法、浸渍法，它们具有提取时间长、提取率低且多酚等活性成分损失量大等缺点。超声波破碎细胞提取法是近几年新兴的提取方法，具有选择性高、提取时间短、提取率高、消耗溶剂少等优点［5］，本试验采用响应面优化法确定中华苦荬菜多酚超声提取最佳条件，并对真空冷冻干燥、红外干燥、自然阴干、烘干及自然晒干的中华苦荬菜多酚得率进行了测定。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

中华苦荬菜，采自河北农业大学校园内，经河北农业大学生命科技学院冯大岭教授鉴定，没食子酸，福林酚，无水乙醇，碳酸钠均为市售分析纯。

kq-500de型细胞超声破碎仪，昆山市超声仪器有限公司;WFZ-UV-2800紫外-可见分光光度计，尤尼科仪器有限公司;真空冷冻干燥机;HW-3型红外干燥箱;DL-101-2型电热鼓风干燥箱，天津市中环实验电炉有限公司;TB-215D分析天平，赛多利斯股份有限公司(德国，感量为十万分之一)。

1.2 中华苦荬菜处理方法

新鲜中华苦荬菜洗净，50℃条件下烘干至恒重，粉碎后过40目，准确称取中华苦荬菜干粉2.000 g，放入一定体积的乙醇溶液，放入超声波破碎仪，提取后抽滤，抽滤液用60%乙醇定容到50 mL容量瓶得到中华苦荬菜提取液，再将此提取液稀释10倍，精密称取试验中稀释后的提取液1 mL，分别加入0.5 mL福林试剂、2 mL质量分数10%Na2CO3溶液，定容至10 mL，室温下反应2 h。在760 nm出测定反应液的吸光度。

1.3 没食子酸标准曲线确定

采用 Folin-ciocalteu 法测定总多酚含量［6－7］。称取25 mg没食子酸，加入到25 mL去离子水中，得到1 mg/mL的没食子酸溶液。吸取5 mL 1 mg/mL的没食子酸溶液，定容至50 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL 的没食子酸溶液，然后配成 0，20，40，60，80，100 μg/mL的没食子酸标液分别标号0～6。取不同标样没食子酸溶液1 mL，分别加入0.5 mL福林试剂、2 mL 10%Na2CO3溶液，定容至10 mL，室温下反应2 h，以0号管为空白用紫外可见分光光度计测定各溶液在760 nm处吸光度，以吸光度(y)为纵坐标，没食子酸浓度(x)为横坐标绘制标准曲线。

1.4 试验设计

1.4.1 单因素试验设计

准确称取处理后的中华苦荬菜干粉2.000 g，放入一定体积的乙醇溶液，放入超声波破碎仪，分别加入不同体积分数的乙醇，按照不同的提取时间、不同的料液比进行超声提取，提取结束后抽滤，抽滤液用60%乙醇定容到50 mL容量瓶中。提取液按照1.2测定提取液吸光度。以标准曲线法计算中华苦荬菜多酚得率，分别确定最适的乙醇体积分数、超声时间和料液比。

1.4.2 响应面试验及优选

根据乙醇体积分数、超声时间和料液比3个单因素试验所确定的水平范围，使用Design-Expert 7.1.3为辅助手段设计响应面试验，选取Box-behnken模型，以多酚得率为响应值，做三因素三水平共17个试验点(5个中心点)的响应面分析试验。确定中华苦荬菜最佳的提取条件。

1.5 中华苦荬菜干燥方法的选择

1.5.1 真空冷冻干燥

将采集的中华苦荬菜全草洗净，放入真空冷冻干燥机的冷冻室，迅速降温至－40℃，保持1 h。再将冻结的中华苦荬菜放入真空干燥室，干燥8h，至样品质量不再发生改变，取出冻干的中华苦荬菜粉碎后过40目，抽真空包装后备用。

1.5.2 红外干燥

将采集的中华苦荬菜全草洗净放入HW-3型红外干燥箱，干燥2 h，干燥结束取出粉碎后过40目，抽真空包装后备用。

1.5.3 阴干

将采集的中华苦荬菜全草洗净，放置到背阴处，48 h后干燥结束，将阴干的中华苦荬菜粉碎后过40目，抽真空包装后备用。

1.5.4 烘干

将采集的中华苦荬菜全草洗净，50℃条件下烘干至恒重，粉碎后过40目，抽真空包装后备用。

1.5.5 晒干

将采集的中华苦荬菜全草洗净，放到太阳直射下，10 h后质量不再发生变化，干燥结束粉碎后过40目，抽真空包装后备用。

1.6 多酚得率的计算

根据标准曲线法将所测定的中华苦荬菜提取液的吸光度带入回归方程计算多酚的提取率。首先将所测得的吸光度带入回归曲线，计算此时所测定反应液的多酚浓度x(μg/mL)。

总得率z=x×500/(2×1 000×1 000)。

其中，500为稀释倍数，2×1 000×1 000为称取中华苦荬菜质量(μg)。(此公式仅适用于此试验)。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线的绘制

根据没食子酸不同浓度标准液得到的吸光度，以吸光度(y)为纵坐标，没食子酸浓度(x)为横坐标绘制标准曲线。结果表明没食子酸浓度在0～100 μg/mL内线性关系良好。如图1所示，回归方程为y=0.011 2x+0.026 5，R2=0.995 7。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 超声提取多酚单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对多酚得率的影响

精确称取中华苦荬菜粉末2.000 g，在料液比1∶20(g∶mL)，提取1 h条件下，分别加入体积分数为30%、45%、60%、75%、95%的乙醇溶液，进行超声破碎提取1 h后，按1.2方法测定，并计算多酚得率。试验结果见图2。

图2 乙醇体积分数对得率的影响Fig.2 Effects of alcohol concentration on extraction rate

从图2可知，随着乙醇体积分数的增大，多酚得率逐渐升高，当乙醇体积分数为60%时，多酚的得率达到最大，总得率为1.91%，当乙醇体积分数继续增大时，多酚得率开始下降，主要原因可能是随着乙醇体积分数的不断增大，溶液的极性逐渐增大，而中华苦荬菜中多酚物质的极性是基本恒定的，根据相似相溶原理，当乙醇体积分数增大到60%时，如果再继续增大，则提取液中因为水极性增大导致提取率开始下降，从而使多酚得率降低。因此选择适宜的乙醇体积分数为45%、60%、75%。

2.2.2 超声提取时间对多酚得率的影响

精确称取中华苦荬菜粉末2.000 g，在料液比1∶20(g∶mL)，乙醇体积分数为60%时，分别提取15、30、45、60、75、90 min，按照 1.2 方法进行测定，并计算多酚得率。试验结果见图3。

图3 超声时间对得率的影响Fig.3 Effects of processing time on extraction rate

从图3可知，随着超声提取时间的增加，多酚得率逐渐升高，当超声提取60 min时，中华苦荬菜多酚得率达到最大，此时得率为1.93%。当提取时间超过60 min时，多酚得率差异性不显著，这可能是超声提取时间过长，导致中华苦荬菜细胞组织破坏，一些不溶性的杂质溢出，从而阻止了多酚成分的溶出。因此选择适宜的超声时间为45、60、75 min。

2.2.3 料液比对多酚得率的影响

精确称取中华苦荬菜粉末2.000 g，在乙醇体积分数为 60%时提取 1 h，分别考察料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL)对中华苦荬菜多酚得率的影响。试验结果见图4。

图4 料液比对得率影响Fig.4 Effects of material-liquid ratio on extraction rate

从图4可知，随着料液比的逐渐增大，中华苦荬菜多酚得率逐渐增大，当料液比为1∶20(g∶mL)时，总得率达到最大，为1.89%。继续增大料液比，多酚的得率差异性不显著。分析原因可能是由于在超声波的作用下，中华苦荬菜中所含多酚类物质已经最大限度溶出，当料液比进一步增大时，其他杂质进入浸提液，从而阻止了多酚成分的溶出。因此选择最适的料液比为 1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL)。

2.3 响应面法优化中华苦荬菜多酚提取工艺

根据Box-behnken中心组合试验设计原理，综合单因素所得试验结果，选取乙醇体积分数、超声时间和料液比3个因素，采用三因素三水平的响应面分析方法，因素水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factorlal levels of RSD

表2 响应面分析方案及结果Table 2 Design scheme and results of central composite test

应用Design-Expert软件进行多元回归拟合分析，得到中华苦荬菜多酚得率与各因素变量的模型Y=1.87+0.18A+0.056B+0.071C+0.067AB－0.013AC+0.030BC－0.36A2－0.057B2－0.18C2。

运用软件对17个响应值进行回归分析得到方差分析表，如表3所示，整体模型P＜0.01，该二次方程模型达到了极显著水平，并且失拟项不显著说明该方程对试验拟合较好。分析表3可知A乙醇浓度对多酚得率达到极显著水平(P＜0.01)，C料液比对多酚得率达到显著水平(P＜0.05)，二次项A2、C2对中华苦荬菜多酚得率曲面效应极显著，交叉项对多酚得率 的影响也较显著。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of extraction rate of flavonoids

2.4 响应面曲面分析

根据回归方程，做出响应面图(见图5～图7)，考察所拟合的响应面的形状，分析乙醇体积分数、超声时间以及料液比对多酚得率的影响。

图5 F(A，B)响应面立体图Fig.5 F(A，B)Response surface perspective view

图6 F(A，C)响应面立体图Fig.6 F(A，C)Response surface perspective view

从图5～图7可见，乙醇体积分数是影响多酚得率的主要因素，料液比对其得率的影响次之，超声时间对其得率的影响较小。在模型浓度的范围内选择出发点，按照模型使用快速上升法进行优化，可得中华苦荬菜多酚提取的最佳方案为乙醇体积分数60%，超声时间60 min，料液比1∶20(g∶mL)，在此工艺条件下，中华苦荬菜多酚得率的预测值为1.86%。

图7 f(B，C)响应面立体图Fig.7 F(B，C)Response surface perspective view

2.5 最佳提取条件验证试验

为检测响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件乙醇体积分数60%，超声时间60 min，料液比1∶20(g∶mL)，实际平均得率为1.85%，与理论值基本相符。

2.6 不同方法干燥的中华苦荬菜多酚得率测定

按照中华苦荬菜多酚的最佳超声提取条件，分别测定真空冷冻干燥、红外干燥、阴干、烘干以及晒干的中华苦荬菜中多酚得率，如图8所示。

图8 干燥方式对得率的影响Fig.8 Effects of drying methods on extraction rate

试验结果表明，真空冷冻干燥的中华苦荬菜多酚得率最高，为3.22%，晒干的中华苦荬菜多酚得率最低，为1.23%，干燥效果依次为冻干＞红外干燥＞烘干＞阴干＞晒干。由此可知，直射光线及空气中长时间放置对多酚得率的影响非常大，容易使多酚含量因氧化而降低。真空冷冻干燥中华苦荬菜在干燥前始终处于低温(冻结状态)，同时冰晶均匀分布于中华苦荬菜中，升华过程不会因脱水而发生浓缩现象，避免了由水蒸气产生泡沫、多酚的氧化等副作用，因此真空冷冻干燥方式所得的多酚得率最高。红外干燥时中华苦荬菜内部水分的湿扩散与热扩散方向是一致的，从而加速了水分内扩散的过程，也即加速了中华苦荬菜的干燥进程，因此短时间内就可干燥结束，从而避免多酚含量的降低。但是考虑到真空冷冻干燥能耗高，干燥时间长等缺点，而红外干燥具有干燥效率高，活性成分损失少等优点，因此建议生产上采用红外干燥的方式，同样能得到较高的多酚含量。

3 结论

采用超声波辅助提取技术对中华苦荬菜多酚进行提取，通过单因素试验和Box-Behnken试验设计及响应面分析对超声波提取工艺进行优化，得出较优工艺条件为乙醇体积分数60%，超声时间60 min，料液比1∶20(g∶mL)，此时多酚得率可达1.85%。用最佳提取条件分别对真空冷冻干燥、红外干燥、自然阴干、烘干及自然晒干的中华苦荬菜中的多酚得率进行测定，试验结果表明真空冷冻干燥的中华苦荬菜多酚得率高，为3.22%，晒干的中华苦荬菜多酚得率低，为1.23%，不同干燥方式得率的大小依次为冻干(3.22%)＞红外干燥(3.05%)＞烘干(1.98%)＞阴干(1.75%)＞晒干(1.23%)。

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