MTNR1B基因rs4753426位点单核苷酸多态性与妊娠期糖尿病的关系

高群，高少波，于莎，詹瑛，李超，刘世国

（青岛大学医学院附属医院妇产科，山东 青岛 266003）

妊娠期糖尿病（GDM）是指在妊娠期首次发生或出现的不同程度的糖耐量异常。尽管目前对于GDM的发病病因和机制还未完全阐明，但多数研究结果认为，GDM是遗传和环境因素共同作用引起的临床综合征［1］。褪黑素（MLT）受体基因1B（MTNR1B）是最新发现的2型糖尿病（T2DM）的候选基因［2］，MTNR1B的多个基因位点是T2DM的易感基因，如研究较多的rs10830963单核苷酸多态性（SNP）与T2DM和GDM具有相关性［3］。已有研究结果显示，MTNR1B基因5′端启动子区中的rs4753426位点周围可能存在某个转录因子的结合位点，可能与 MLT的表达水平相关［4］。通过对不同种族人群 MTNR1B－rs4753426（C／T）位点的研究显示，C等位基因是突变基因，且与FPG水平升高密切相关［5］。本研究采用聚合酶链反应（PCR）和DNA测序技术判定MTNR1B－rs4753426位点基因型和等位基因频率在GDM孕妇和正常孕妇间的差异，旨在探讨rs4753426位点SNP与GDM发病的关系。现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2011年7月—2012年7月，选取我院产科门诊或住院GDM孕妇93例为GDM组，年龄（30.85±9.46）岁，孕周（25.65±3.84）周，体质量指数（BMI）（22.99±4.97）kg／m2。另选取同期正常孕妇165例为对照组，年龄（28.96±8.52）岁，孕周（26.84±2.76）周，BMI（23.47±5.48）kg／m2。两组年龄、孕周、孕产次、BMI等相比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究受检者均符合美国糖尿病协会（ADA）的诊断标准［6］。所有研究对象均为中国汉族北方人。所选孕妇均除外多胎妊娠、慢性高血压、T1DM或T2DM、感染、肾功能异常、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等。本研究经医院伦理委员会批准，孕妇均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集和相关指标检测 各组孕妇均于清晨空腹6～8 h后行口服75 g葡萄糖耐量试验（OGTT），同时采集空腹静脉血5 mL测定空腹胰岛素（FIN）和空腹血糖（FPG）水平，FIN测定采用放射免疫法（美国LINCO公司试剂盒），FPG测定采用日立7600－2020生化自动分析仪；另采集每例孕妇的静脉血3 mL，EDTA抗凝，－20℃条件下保存，用于提取DNA。记录孕妇首次产前检查（孕6～12周）的身高、体质量，计算孕前BMI；采用稳态模型评估法计算胰岛素抵抗指数（HOMA－IR）及胰岛β细胞功能指数（HOMA－β）。

1.2.2 MTNR1B－rs4753426位点SNP检测 用改良Miller法提取全血DNA，经检测基因组DNA浓度（10～20 mg／L）合格，基因组DNA －20℃冰箱保存。采用PCR对目的基因进行扩增。引物序列应用Pri mer 5软件进行设计，引物序列：上游引物5′－CTCAATACCCACCCTCAA－3′，下游引物5′－CCAACAGAAGAATGGATAAG－3′。PCR 反 应 过程：总反应体系20μL，95℃预变性5 min；然后94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；最后72℃延伸7 min。取PCR扩增产物2μL，于15 g／L琼脂糖凝胶上电泳。将扩增产物及PCR上游引物送至上海申速生物技术有限公司进行测序，采用Sanger双脱氧链终止法应用ANI PRISM 3730XL测序仪进行DNA测序。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料结果以±s表示，两组间比较采用t检验；基因型及等位基因频率以率表示，统计处理采用χ2检验；应用Har dy－Weinber g遗传平衡定律检验两组基因型群体代表性分布。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组孕妇各临床观察指标的比较

GDM组孕妇FPG、FIN水平及 HOMA－IR高于对照组，差异均有显著性（t＝2.518～6.074，P＜0.05）。GDM组孕妇HOMA－β低于对照组，差异有显著性（t＝18.391，P＜0.05）。见表1。

表1 两组孕妇各临床观察指标的比较（±s）

表1 两组孕妇各临床观察指标的比较（±s）

组别 n 年龄（岁） 孕周（周） BMI（kg／m2） FPG（c／mmol·L－1） FIN（z／mU·L－1） HOMA－IR HOMA－β对 照 组 165 28.96±8.52 24.84±2.96 23.47±5.48 4.62±1.87 15.37±11.26 2.96±2.79 274.46±50.21 GDM组 93 30.85±9.46 25.65±3.84 22.99±4.97 6.43±2.75 19.96±15.41 5.95±4.26 130.59±65.35

2.2 两组孕妇MTNR1B－rs4753426位点基因型与等位基因频率比较

采用PCR扩增产物直接DNA的测序结果显示，rs4753426位点存在CC、CT、TT等3种基因型。两组基因型频率分布均符合Har dy－Weinber g遗传平衡定律（P＞0.05）。GDM组CC、CT和TT基因型频率分别为72.04%、21.51%和6.45%，对照组CC、CT、TT基因型频率分别为53.94%、40.00%和6.06%，两组比较，差异有显著性（χ2＝9.342，P＜0.05）。GDM 组 MTNR1B－rs4753426位点C、T等位基因频率分别为82.80%、17.20%，对照组分别为73.94%、26.06%，两组比较，差异也有显著性（χ2＝5.285，P＜0.05）。

3 讨 论

MLT是生物体内普遍存在的一种吲哚类激素，在哺乳动物和人体内主要由脑部松果腺分泌，其分泌受光照影响，表现为明显的昼低夜高的节律变化，它调节着昼夜节律、睡眠、内分泌、免疫及抗衰老等多种重要生理功能。人类MLT的调节作用由MLT受体1（MT1）和MT2介导，两种受体都是G－蛋白耦联受体。MTNR1B定位于染色体11q21－122（8）上。其转录受体介导了MLT对胰岛素分泌的抑制作用，其对胰岛素分泌的抑制作用可能导致胰岛素分泌的昼夜节律［7］。MTNR1B基因与FPG水平及胰岛β细胞功能密切相关［8］，已成为目前研究T2DM和GDM遗传发病机制的热点之一。研究结果显示，MTNR1B基因主要在视网膜和脑组织中表达，同时该基因转录产物在胰岛β细胞中表达，通过MLT信号转导途径，介导对胰岛素分泌的调节，在T2DM的发生发展中起重要作用［9］。随着人类全基因组SNPs研究的不断深入，迄今为止已发现了MTNR1B基因的多个位点，如rs10830963、rs－1387153、rs4753426等位点的SNP与T2DM发病风险相关，其中研究较多的是rs1083963位点，多项研究显示，该位点的CG和GG基因型与FBG水平和T2DM患病风险显著相关［10］。国内研究也证实rs1083963位点G等位基因与T2DM和GDM发病风险的相关性［11］，但尚未见rs4753－426位点 SNP与T2DM或GDM的相关性研究。

研究证实，MTNR1B基因rs4753426位点位于MTNR1B基因上游调节区内。QIU等［12］利用TF Search基因软件对rs4753426 DNA序列进行潜在转录因子的研究，发现了位于其附近的转录因子（v－Myb）的结合位点，并进一步证实rs4753426位点的不同等位基因的改变，可导致MTNR1B的表达水平的差异。通过研究德国索布地区人群MTNR1B－rs4753426（C／T）位点显示，C等位基因是突变基因，rs4753426位点CC和CT基因型均与T2DM的发病风险密切相关［13］。

本研究结果证实，GDM孕妇存在FPG水平升高、高胰岛素血症和严重的IR，与其他研究结果一致［14］。传统理论认为，由于妊娠期各种妊娠激素和细胞因子的影响，胰岛素分泌处在可代偿或更高水平，以维持正常血糖的稳态，目前导致GDM病人胰岛素抵抗的机制仍不十分清楚，但遗传易感因素与环境的共同作用不容忽视。

本研究通过对93例GDM孕妇和165例正常孕妇进行对照研究，结果显示，两组孕妇基因型频率比较，差异具有显著性。提示MTNR1B rs4753426位点与GDM的发生具有相关性。GDM组的C等位基因频率明显高于对照组，差异也有显著性，提示rs4753426位点的C等位基因频率在GDM组孕妇中明显升高，携带C等位基因孕妇GDM发病风险可能较高。

总之，本文的研究结果显示，rs4753426位点与GDM存在相关性，可能是GDM的易感基因位点，与其他易感位点是否具有协同作用导致GDM有待进一步研究。虽然研究已显示MTNR1B基因是与T2DM关联性很强的基因之一，但该基因似乎有多个SNPs位点与T2DM遗传易感性相关［15］，因此进一步研究MTNR1B基因SNP在GDM发病中的作用具有重要意义。

表2 两组孕妇MTNR1B－rs4753426基因型频率与等位基因频率比较（例（χ／%））

［1］HONGYAN MAO，QIN L I，SHUJUN GAO.Meta－analysis of the relationship between common type 2 diabetes risk gene variants with gestational diabetes mellit us［J］.PLoS One，2012，7（9）：e45882.

［2］CHA MBERS J C，ZHANG W，ZABANEH D，et al.Common genetic variation near melatoninrecept or MTNR1B contributes to raised plasma glucose and increased risk of type 2 diabetes a mong Indian Asians and Eur opean Caucasians［J］.Diabetes，2009，58（11）：2703－2708.

［3］KI M J Y，CHEONG H S，PARK B L，et al.Melatonin recept or 1 B polymor phisms associated with the risk of gestational diabetes mellitus［J］.BMC Med Genet，2011，10：12：82.

［4］GATECKA E，SZEMRA J，FLORKOWSKI A，et al.Single nucleotide polymor phis ms and mRNA expression for melatonin MT2 receptor in depression［J］.Psychiatr y Res，2011，189（3）：472－474.

［5］JI L D，XU J，WU D D，et al.Association of disease－predisposition polymor phis ms of the melatonin receptors and sunshine duration in the global hu man populations［J］.J Pineal Res，2010，48（2）：133－141.

［6］YANG H X.Diagnostic criteria for gestational diabetes mellit us（WS 331－2011）［J］.Chin Med J：Engl，2012，125（7）：1212－1213.

［7］汪娅.褪黑素及其受体与糖尿病关系的研究进展［J］.重庆医学，2012，41（12）：1128－1231.

［8］TA M C H，HO J S，WANG Y，et al.Co mmon poly morphis ms in MTNR1B，G6PC2 and GCK are associated with increased fasting plasma glucose and i mpaired beta－cell function in Chinese subjects［J］.PLoS One，2010，5（7）：e11428.

［9］胡敬，季虹，荣海钦.MTNRl B基因多态性与2型糖尿病［J］.国际遗传学杂志，2010，33（5）：306－309.

［10］VLASSI M，GAZOULI M，PALTOGLOU G，et al.The rs10830963 variant of melatonin receptor MTNR1Bis associated with increased risk for gestational diabetes mellit us in a Greek population［J］.Hor mones：At hens，2012，11（1）：70－76.

［11］邓志凤，舒青青，陈友好，等.褪黑素受体1B基因rs10830963位点多态性与妊娠期糖尿病遗传易感性的关系［J］.中华围产医学杂志，2011，14（11）：666－669.

［12］QIU X S，TANG N L，YEUNG H Y，et al.Melatonin receptor 1B（MTNR1B）gene poly morphism is associated with the occurrence of adolescent idiopathic scoliosis［J］.Spine，2007，32（16）：1748－1753.

［13］DIETRICH K，BIRK MEIER S，SCHLEINITZ D，et al.Association and evolutionary studies of the melatonin receptor 1B gene（MTNR1B）in the self－contained population of Sorbs fro m Ger many［J］.Diabet Med，2011，28（11）：1373－1380.

［14］张宁，叶元华，徐金娥，等.IRTK与妊娠期糖尿病胰岛素抵抗的关系［J］.青岛大学医学院学报，2011，47（2）：123－125.

［15］STAIGER H，MACHICAO F，SCH FER S A，et al.Polymorphisms within the novel type 2 diabetes risk locus MTNR1B deter mine beta－cell function［J］.PLoS One，2008，3（12）：e3962.