胱抑素C在巴斯德毕赤酵母的高效分泌表达及免疫原性分析

王清，葛莹，宋广辉，赵素芝

（1 青岛大学医学院附属医院检验科，山东 青岛 266100； 2 山东省煤炭泰山疗养院内二科）

血清胱抑素C（Cys C）作为一种新的反映肾小球滤过率（GFR）的内源性标志物，为判断肿瘤、肝硬化、肾衰竭等疾病中GFR的变化提供了快速、精确而又简单的方法。有人已经原核表达了Cys C，由于融合蛋白以包涵体形式存在，包涵体蛋白的复性和纯化过程非常复杂，而且由于原核生物密码子的偏性，导致了真核基因在原核表达系统表达率较低［1］。毕赤酵母表达系统作为一种适宜表达外源基因的真核表达系统，得到了广泛的应用［2］。本研究利用该表达系统，使Cys C基因在巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）中表达，并对表达产物进行了免疫原性分析。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 P.pastoris GS115（His－，Mut＋）和质粒p PIC9k由本室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器 限制性内切酶（Takara生物技术有限公司），蛋白分子质量标准（上海拜力生物科技有限公司），G418、生物素、酵母氮源（YNB）和硝酸纤维素膜（上海生工生物工程有限公司），颗粒增强透射免疫比浊法（PETIA）CysC检测试剂盒（北京利德曼生物技术有限公司），Bio－Rad Gene Pulser电转化仪、CysC蛋白标准品（新城生物科技股份有限公司），鼠抗人CysC单克隆抗体（Abcam公司，英国）。

1.1.3 培养液 YEPD：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，p H 6.0，115℃湿热灭菌20 min。MD：13.4 g／L YNB，4×10－4g／L生物素，20 g／L葡萄糖，15 g／L琼脂。BMGY：2 g／L蛋白胨，1 g／L酵母提取物，100 mmol／L磷酸钾缓冲液（p H 6.0），13.4 g／L YNB，4×10－4g／L生物素，1 g／L甘油。BMMY：将 BMGY 中的1 g／L甘油替换为5 g／L甲醇。MM：13.4 g／L YNB，4×10－4g／L生物素，5 g／L甲醇。

1.2 方法

1.2.1 构建携带合成Cys C基因的重组表达载体p PIC9k－Cys C 根据 Cys C的 mRNA 序列（Gen－Bank公布）进行分析，按照P.pastoris GS115（His－，Mut＋）表达系统密码子偏好［3］，优化基因序列，检查基因内部有无特别复杂二级结构和重复序列；用P.pastoris GS115（His－，Mut＋）偏爱的密码子替代野生型Cys C基因序列中的酵母稀有密码子，调整GC含量，消除富含AT的序列区段，避免翻译的提前终止，并且避免可能影响mRNA稳定性的连续5个或5个以上的A／T或G／C重复序列。合成Cys C基因经同义密码子修改以后，所编码蛋白质的氨基酸序列并未发生变化。根据基因序列的分析结果，人工合成Cys C，连接至目的载体p PIC9k，构建p PIC9k－Cys C并转化到感受态细胞DH5中，测序，验证重组克隆中基因序列是否与要求相符。

1.2.2 转化P.pastoris GS115 将5～20μg质粒DNA用SalⅠ线性化，电转化GS115细胞（参数：电压1.5 k V，电容25μF，电阻200Ω），电击时间4～10 ms，His＋转化子接种到无组氨酸的MD平板上，30℃培养3～4 d。然后，PCR分析目的基因是否整合到基因组中。设计一对用于扩增插入片段的引 物，引物序列如下：5′AOX1－F，5′－GACTGGTTCCAATTGACAAGC－3′；3′AOX1－R，5′－GCAAATGGCATTCTGACATCC－3′。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，25个循环；72℃延伸10 min。

1.2.3 重组酵母阳性转化子的多拷贝整合筛选根据p PIC9k中的表达手册（Invitr ogen公司）筛选多拷贝整合菌株。将转化菌落分别点在G418浓度分别为0.5、1.0、2.0、3.0 g／L的 YEPD培养板上，30℃培养3～4 d，筛选多拷贝整合菌株。然后将高拷贝的重组子分别对应点于MM和MD培养板上，筛选His＋Mut＋阳性克隆。

1.2.4 Cys C的诱导表达 将G418筛选出的高拷贝转化子3株分别接种于100 mL BMGY增菌培养液中，28～30℃、280 r／min振荡过夜至A600为3～6。3 000 r／min离心5 min收集细胞，在4℃下将细胞沉淀物重新悬浮在500 mL含10 g／L酪氨酸BMMY（p H 6.0）培养液中，使悬浮液A600＝1。每24 h加10 g／L甲醇，诱导表达5 d，收获的时间间隔为0、24、48、72、96和120 h，用 PETIA Cys C检测试剂盒确定最佳收获时间。空载体p PIC9k转化子作为阴性对照，在相同条件下被诱导。

1.2.5 SDS－PAGE和 Wester n blot分析 取30 μL培养物上清液在120 g／L SDS－PAGE上电泳，考马斯亮蓝R－250染色。通过SDS－PAGE分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后用鼠抗人Cys C单克隆抗体（1∶1 000稀释）孵育，并用小鼠抗兔Ig G（1∶4 000稀释）与辣根过氧化物酶（HRP）耦联。洗膜，用四甲基联苯胺（T MB）反应10 min。

1.2.6 动物免疫及血清抗体检测 将Bal b／c小鼠随机分为A组和PBS组，每组12只。A组每只小鼠皮下注射50μg纯化的酵母表达重组蛋白和等体积完全弗氏佐剂，PBS组注射PBS和等体积完全弗氏佐剂。首次免疫后14 d加强免疫1次，7 d后再免疫1次，追加免疫用不完全弗氏佐剂，共免疫3次。眶静脉取血，4℃放置分离血清，－20℃冻存备用。应用标准品Cys C蛋白作为抗原间接ELISA检测免疫小鼠血清中抗Ig G抗体。

1.2.7 Cys C定量测定 用PETIA Cys C检测试剂盒确定最佳收获时间。取各个时间间隔少量培养液，离心后用日立全自动生化分析仪PETIA Cys C试剂盒测定Cys C浓度，严格按说明书操作。

2 结 果

2.1 优化后的Cys C基因

120个氨基酸密码子中有77个进行了优化，消除避免可能影响mRNA稳定性的连续5个或5个以上的A／T或G／C重复序列9处，中止子由TAG转换为TAA。优化基因序列后GC含量由原来的60.8%降低到37.7%。合成的基因使用同义的密码子而氨基酸序列没有变化。所设计的合成Cys C基因与野生型Cys C基因序列对比见表1。

表1 合成CysC基因与野生型CysC基因序列对比

2.2 重组质粒p PIC9k－Cys C的鉴定

以少量碱裂解法快速提取的重组质粒p PIC9k－Cys C，经Eco RⅠ及NotⅠ双酶切及DNA序列分析显示，重组质粒p PIC9k－Cys C符合设计要求，重组克隆构建成功。

2.3 重组质粒对酵母菌的转化及转化子的鉴定

电转化法转化毕赤酵母，能产生足够数量的转化体。

2.4 SDS－PAGE分析

阳性表达菌在相对分子质量约19 000处有一条带，空载体阴性对照菌未见该条带。表达水平与拷贝数呈正比，即高拷贝高表达，产物约占分泌总蛋白的80%以上（图1）。

图1 表达产物的SDS－PAGE分析

2.5 Wester n blot测定

通过SDS－PAGE分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，能与相应Cys C抗体形成单一蛋白条带，证明表达纯化的蛋白是Cys C蛋白（图2）。

2.6 Cys C抗血清效价和特异性鉴定

ELISA间接法测定抗血清效价为1∶8 000；Wester n blot测定显示抗血清能与Cys C标准品发生免疫反应。

2.7 Cys C定量测定

Cys C定量测定结果显示，Cys C高拷贝转化子诱导表达的最佳收获时间为120 h，其上清液浓度达到600～950 mg／L。

图2 CysC表达蛋白鉴定

3 讨 论

Cys C是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，在抗病毒、抑制肿瘤的生长、预防食品加工过程中蛋白水解方面具有潜在的应用价值。此外，内源性Cys C是一种检测GFR的新指标。虽然已在大肠埃希菌中表达了Cys C融合蛋白，但该蛋白多以包涵体形式存在，而且由于原核生物密码子的偏性，导致了大肠埃希菌为宿主菌的原核表达产物量低［1－4］。

为了高纯度、高产量表达Cys C蛋白，本研究选择了p PIC9k作为表达载体，并在P.pastoris GS115中表达Cys C。因为许多外源蛋白质在酵母中表达，得到类似于在哺乳动物细胞中产生的、结构和生物活性相似的天然的蛋白质［5－6］。此外，p PIC9k中的α因子分泌信号序列，使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。p PIC9k为整合型分泌表达载体，毕赤酵母His＋转化子高拷贝整合事件自发发生的概率为1%～10%，p PIC9k含有细菌kan基因，赋予毕赤酵母遗传霉素抗性。遗传霉素抗性水平主要依赖整合的kan基因的数目。单拷贝p PIC9k整合入毕赤酵母基因组后，赋予P.pastoris约0.25 g／L的遗传霉素抗性水平。任何载体多拷贝整合可增加遗传霉素抗性水平，从0.5 g／L（1～2拷贝）到4.0 g／L（7～12拷贝）。由于kan基因与表达盒（p AOX1及目的基因）之间有遗传连锁，可从遗传霉素高抗性推断该克隆所包含多拷贝目的基因数［7］。由于基因的剂量效益，蛋白的表达可能会增加，拷贝数越高表达量也越高［8］。

外源蛋白可在P.pastoris胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌至胞外。P.pastoris只分泌很少的自身蛋白，加上P.pastoris最小生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要组成成分，也可算作蛋白纯化的第一步。

在P.pastoris中表达较高的基因往往是采用P.pastoris本身所偏爱的密码子，研究也表明在所有61个密码子中有25个是P.pastoris偏爱的。赵翔等［9］通过对P.pastoris的28个蛋白编码同义密码子的使用情况进行分析，确定了P.pastoris的19个高表达优先密码子。多位学者通过对密码子进行优化，改良基因，大大提高了异源基因在P.pastoris中的表达［10－12］。

在以往的研究中，P.pastoris表达的Cys C基因均使用野生型基因［13］，其密码子可能不是宿主细胞进行高水平表达所偏爱的密码子，因此表达水平应有提升空间。本研究根据P.pastoris表达系统的特性，在氨基酸序列不变的条件下，重新设计Cys C基因，去除复杂的二级结构和重复序列，调整GC含量，消除富含AT的序列区段，避免翻译的提前终止，并且避免可能影响mRNA稳定性的连续5个或5个以上的A／T或G／C重复序列。在120个氨基酸密码子中有77个进行了优化，消除避免可能影响mRNA稳定性的连续5个或5个以上的A／T或G／C重复序列9处，终止子由TAG转换为TAA。优化基因序列后，GC含量由原来的68.6%降低到43.6%。通过密码子优化，Cys C的表达水平达到600～950 mg／L的标准，虽然其数值略低于通常高5～10倍的密码子优化的研究结果［14］，但它仍然高于其他研究结果［15］。

本研究用P.pastoris表达重组Cys C的优点为：①在酵母真核表达系统中进行重组表达，表达产物无需包涵体的变性和复性处理，也不需融合蛋白的凝血酶切割，诱导表达后收集培养液上清即可得到活性的Cys C；②表达量高，杂蛋白很少，表达量可以达到克级，即使不纯化，蛋白纯度也可达到80%以上；③根据酵母密码子偏好，优化Cys C序列，可以进一步提高Cys C表达量。可见，根据P.pastoris密码子的偏好，将人Cys C基因进行密码子优化和表达，为外源基因的表达提供了一种理想的方法。

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