钙敏感受体激活对缺血再灌注兔心脏电生理特性的影响*

李海涛

海南省人民医院心脏中心 海口 570311

虽然再灌注心律失常的发生机制目前尚未完全明确，但研究[1]证实再灌注时存在一过性的胞内钙超载，表明其发生可能与细胞内钙离子的水平与分布高度相关。近期研究证实缺血性心律失常的发生主要起源于折返激动[2]，缺血时由于受到低能量及低氧供的影响，心肌离子通道功能在一定程度上被抑制，而由于各部位离子通道的密度、分布及种类的不同，导致了其抑制程度的不一致，从而引起动作电位在缺血心肌中呈现不均一性，易于发生折返激动，而对于一过性钙超载的抑制能够有效遏制缺血再灌注心律失常的发生[3]。相关研究[4]还证实，在大鼠心肌组织存在钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR),其功能主要是维持钙离子稳态，在心肌缺血再灌注损伤过程中，CaSR参与了细胞内钙超载的发生。但目前对于CaSR是否影响再灌注心律失常的发生及是否与电生理指标的改变有关尚无明确的结论。因此，作者应用心脏缺血再灌注家兔模型，观察CaSR激活对再灌注心律失常的影响。

1 材料与方法

1.1心脏缺血再灌注动物模型的制备以家兔冠脉结扎模拟心脏缺血再灌注过程。以30 g/L戊巴比妥钠溶液30 mg/kg静脉注射麻醉家兔，将银制电极植入动物皮下记录体表心电图，经胸骨正中切口切开胸廓, 剪开心包并暴露左前降支，在第一对角支分出处远端3 mm处平行放置一根缝线打一活结进行结扎，其标志为模拟心电图ST段明显抬高，结扎局部心肌由红色转为暗白色。30 min后解开活结，恢复血流灌注3 h。开胸后，用微型注射器吸取体积分数10%甲醛溶液0.5 mL注入兔上腔静脉与右心房交界处的窦房结区域进行化学消融，以抑制窦房结功能，避免窦性心律对程序电刺激的干扰。在家兔心率下降至60 min-1以下后开始程序电刺激。

1.2实验分组选取成年新西兰大耳白兔80只，雌雄不拘，体质量2～3 kg，由武汉大学人民医院实验动物中心提供。动物随机分组，按1.1制备模型；将CaSR激动剂盐酸R-568(Tocris公司)溶于DMSO中，术前新鲜配制，加入10 mL生理盐水中,于麻醉后冠脉结扎开始前30 min分别按0.00(未用药组)、0.01、0.10和1.00 μmol/(L·kg)的剂量经微量泵耳缘静脉输入，给药速度为10 mL/h,分别于给药前、给药后15 min、缺血时相和再灌注时相进行电生理指标的测定。每个时相每种处理组5只动物。

1.3电生理指标测定用三维式液压操纵器将拉制的尖端为0.5 μm、内充3.0 mmol/L KCl、阻抗为15～20 MΩ玻璃微电极插入心肌，其中一微电极垂直插入外层心室肌细胞，另一微电极垂直插入内层心室肌细胞，引出细胞内动作电位并录入计算机，用Acknowledge 3.72 软件对动作电位进行图像分析，计算出动作电位由0期至复极达90%的时间(APD90)，APD90为连续测定的20个值的平均值；计算最大跨室壁复极离散度(TDR)，TDR为内外膜间同一轴向位点上APD90最大值与最小值之间的差值。

1.4程序电刺激方式S1S2刺激设置为S1S2=81, S1S1间期定为1 000 ms, S1S2间期从200 ms开始，步长为10 ms行负扫直至达到不应期或达到如下任何一种电生理现象出现为止：刺激呈21激动心室肌；出现室性心动过速(ventricular tachycardia,VT)、室扑或室颤(ventricular fibrillation,VF)；出现动作电位电交替。

1.5统计学处理用SPSS 13.0进行统计学分析。采用4×4析因设计的方差分析对各组APD90及TDR进行比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组室性心律失常诱发率在再灌注时相，0.01、0.10和1.00 μmol/(L·kg)组的恶性室性心律失常诱发次数均多于0.00 μmol/(L·kg)组。详见表1。

2.2各组APD90及TDR的比较见表2～4。与未用药组比较，各药物处理组缺血时相APD90显著延长，但TDR无明显改变；在再灌注时相，各药物处理组APD90和TDR均显著延长。

表1 各组VT与VF诱发次数(n=5)

表2 各组内膜APD90的比较(n=5) ms

F时间=23.147，F组间=68.241，F交互=18.624，P均<0.001。

表3 各组外膜APD90的比较(n=5) ms

F时间=26.771，F组间=44.734，F交互=17.352，P均<0.001。

表4 各组外膜TDR的比较(n=5) ms

F时间=9.014，F组间=11.249，F交互=16.624，P均<0.001。

3 讨论

既往研究证实在心肌缺血再灌注相关心律失常的发生中，由于能量物质不足可以引起心肌细胞线粒体氧化磷酸化功能障碍，与其邻近的肌浆网受到一过性钙离子及活性氧族物质超载影响，使心肌细胞内钙离子转运体系运作异常[5]，导致心肌细胞膜动作电位时程的震荡；缺血心肌和正常灌注心肌之间边界区域不应期的离散度增加，导致细胞自律性增高及心肌组织间传导阻滞，引起折返性心律失常[6]，这类钙超载主要发生在再灌注期，且主要是由于钠钙交换异常及L-型钙通道的开放所引起[7]。

CaSR属G蛋白偶联受体家族，在维持心肌细胞钙离子稳态方面起重要作用[8]。既往研究[9]已证实CaSR在缺血心肌表达增加，其激活可引起肌浆网内钙释放增加，导致细胞内游离钙增加，是不同于经典缺血相关钙超载机制的另一细胞内钙离子调节途径。

该实验中，作者发现，在盐酸R-568作用后，缺血再灌注模型动物心肌室性心律失常发生率显著增加，缺血时相APD90延长，再灌注时相TDR明显增大，提示CaSR激活增加了心肌电生理不均一性，再灌注阶段该受体进一步激活可引起外钙内流增加，使胞浆内钙离子大量增加，加剧缺血心肌一过性钙超载的发生，损害了细胞内膜电位稳定性，从而使电兴奋发生碎裂和碰撞，易于形成折返，使整个心脏室性心律失常发生阈值降低。

综上所述，钙敏感通道在缺血再灌注心律失常的发生中有其独特的地位，可作为此类心律失常治疗的一个新靶点。

[1]王阳,米树华,贾淑杰,等.心肌缺血再灌注损伤药物研究现状及进展[J].中国实用内科杂志,2012,32(12):958

[2]Sidorov VY,Uzelac I,Wikswo JP.Regional increase of extracellular potassium leads to electrical instability and reentry occurrence through the spatial heterogeneity of APD restitution[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011,301(1):H209

[3]Jie X,Gurev V,Trayanova N.Mechanisms of mechanically induced spontaneous arrhythmias in acute regional ischemia[J].Circ Res，2010,106(1):185

[4]Sun J,Murphy E.Calcium-sensing receptor:a sensor and mediator of ischemic preconditioning in the heart[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010,299(5):H1309

[5]Assayag M,Saada A,Gerstenblith G,et al. Mitochondrial performance in heat acclimation：a lesson from ischemia/reperfusion and calcium overload insults in the heart[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2012,303(8):R870

[6]Wang S,Chen J,Valderrábano M.Nutrient restriction preserves calcium cycling and mitochondrial function in cardiac myocytes during ischemia and reperfusion[J].Cell Calcium，2012,51(6):445

[7]Antoons G,Willems R,Sipido KR.Alternative strategies in arrhythmia therapy:evaluation of Na/Ca exchange as an anti-arrhythmic target[J].Pharmacol Ther，2012,134(1):26

[8]Ullrich ND,Valdivia HH,Niggli E.PKA phosphorylation of cardiac ryanodine receptor modulates SR luminal Ca2+sensitivity[J].J Mol Cell Cardiol，2012,53(1):33

[9]Zheng H,Liu J,Liu C.et al.Calcium-sensing receptor activating phosphorylation of PKCδ translocation on mitochondria to induce cardiomyocyte apoptosis during ischemia/reperfusion[J].Mol Cell Biochem，2011,358(1/2):335