不同方法制备钛种植体对成骨细胞黏附影响的体外研究

崔晓明， 陈良建， 郑 遥

(1西安医学院口腔医学系， 西安 710021;2中南大学湘雅三医院口腔科;3北京世纪坛医院口腔科)

钛及钛合金因其良好的力学性能和生物相容性被广泛应用于牙种植体，种植体植入牙槽骨以后，理想的状态是形成骨性结合。成骨细胞在种植体表面的黏附是种植体骨界面生物学反应的第一步，对骨性结合的形成至关重要［1，2］。粗糙多孔的表面能诱导细胞的“接触引导”［3］作用，从而有利于细胞黏附［4，5］。目前普遍认为喷砂处理的粗糙表面较好，成为临床常用的种植体表面粗化方法。本研究采用TiO2颗粒喷砂和粉末注射成形(MIM)两种方法制备多孔钛种植体，并比较成骨细胞在两组材料表面的黏附率及黏附形态，以探索出更有利于成骨细胞黏附的种植体制备方法。

1 材料与方法

1.1 材料的分组

本试验所用种植体均为直径8 mm，厚3 mm的圆形钛片，由中南大学粉末冶金国家重点试验室提供。将钛片分为四组，分别为Sm组(光滑组)、Sa组(喷砂组)、M1组(MIM制备，孔隙度为40%)、M2组(MIM制备，孔隙度为60%)。

1.2 材料的制备与表面处理

Sm组:选择直径8 mm，厚3 mm的圆形致密钛，以320目、500目、800目水砂纸逐级打磨。先后以丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗各10 min，60℃烘干箱干燥，高温高压消毒后备用。

Sa组:选择直径8 mm，厚3 mm的圆形致密钛，以320目、500目、800目水砂纸逐级打磨。丙酮、无水乙醇超声清洗20 min，蒸馏水清洗3遍干燥，备用。以TiO2砂对已经砂纸打磨的钛片表面进行喷砂处理，至表面呈均匀的灰色。处理后，先后以丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗各10 min，60℃烘干箱干燥，高温高压消毒后备用。

M1及M2组:粉末原料由HDH Ti(＜77μm)，TiH2(＜65μm)，NaCl(＜290μm)组成，均呈不规则形状。将其与黏接剂(主要成分为石蜡、高密度聚乙烯和聚乙醇等)混合制粒，采用MIM技术制备生坯，经脱盐脱脂，在真空度为10－3Pa经1 100℃烧结，制备孔隙度分别为40%、60%，直径为8 mm，厚3 mm圆形钛片。先后以丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗各10 min，60℃烘干箱干燥，高温高压消毒后备用。

1.3 表面形貌观察

随机抽取4组种植体中各3片，在扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)下观察各组种植体的表面形貌。

1.4 成骨细胞体外培养

将MG63(购买于中南大学医学试验中心)成功复苏后于5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱内培养，48 h换液一次，培养液为低糖DMEM培养液(含10%已灭活小牛血清)。待细胞长满培养瓶底后，用0.25%胰酶消化1 min，当细胞开始收缩变圆时倒去消化液，加入含10%小牛血清的培养基终止消化，然后用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，按1∶3传代。倒置显微镜下观察成熟MG63的形态。

1.5 种植体表面成骨细胞形态学观察

以0.25%胰酶消化MG63，以10%小牛血清的DMEM调整至浓度为1.5×104个/ml的悬液，用加样器取2 ml细胞悬液分别接种于放有4组钛种植体的24孔培养板内，每样本设5复孔，培养8 d后用倒置显微镜观察种植体边缘成骨细胞的形态。吸去培养液，加4℃预冷的2.5%戊二醛固定，4℃保存。酒精梯度脱水，临界点干燥，喷金，将种植体置于扫描电镜下观察成骨细胞在种植体表面的黏附形态。

1.6 种植体表面成骨细胞黏附率的测定

以0.25%胰酶消化MG63，以10%小牛血清的DMEM调整至浓度为1.5×104个/ml的悬液，用加样器取2 ml细胞悬液分别接种于放有4组钛种植体的24孔培养板内，每样本设5复孔，分别在培养第4，8天后吸去培养液并用PBS冲洗3次，每孔加入无血清的DMEM及 MTT，再培养4 h，加三联液(质量分数10%十二烷基硫代硫酸钠25 g、5%异丁醇12.5 ml、0.012 mol/L 盐酸0.3 ml，加三蒸水补足250 ml)，继续培养12 h，吸取各孔培养液于490 nm酶联免疫仪(Bio－Tek公司)测定吸光度值(optical density，OD)。OD值与所测培养孔中MG63浓度成正比，从而能够准确反映各组成骨细胞黏附率之间的关系。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 种植体表面形貌

2.1.1 肉眼观察 Sm组表面银白色金属光泽，表面划痕均匀一致;Sa组表面呈深灰色，无金属光泽，表面孔隙形态较规则;MIM组表面呈浅灰色，孔隙形状不规则，M2组较M1组孔隙明显增多。

2.1.2 扫描电镜观察 由图1(见第86页)可看出，Sm组表面可见方向一致的划痕，偶见裂隙和点状凹陷;Sa组表面呈多级孔洞，蜂窝状，表面颜色、形态均匀一致，孔径分布在80－300μm;M1组表面粗糙，各个孔洞独立存在，未见连通孔结构，孔径主要分布在50－400μm;M2组孔隙增多，呈蜂窝状，形成连通孔结构，孔径主要分布在50－400μm。

2.2 MG63 光镜观

倒置显微镜下观察成熟MG63的形态显示，细胞呈梭形，胞体舒展铺于瓶底，彼此成条索状排列，胞质丰富，胞核卵圆(图2)。

图2 体外培养成熟MG63 (×100)Fig 2 Morphology of mature MG63 cultured in vitro(×100)

2.3 MG63在种植体表面黏附形态

在倒置光学显微镜下，4组材料边缘成骨细胞在数量上及形态上无明显差。材料边缘成骨细胞数量较多，部分细胞伸出伪足，紧贴材料侧面垂直生长，形态及大小与其他部位细胞无明显差别(图3)。

由图4可看出，在SEM下Sm组成骨细胞平铺于材料表面，细胞呈长梭形或多边形，伪足少，扁平，因点状凹陷直径过小，细胞跨过凹陷的两端平铺于表面，细胞排列方向与表面划痕无特定关系。Sa组成骨细胞伸展良好，呈扁平状，形态各不相同，在材料表面孔径与MG63大小相当的孔隙内，细胞呈桥状生长，伪足不多，附着在孔洞边缘，与材料表面结合较紧密。M1组成骨细胞多呈不规则多边形，伸展良好，伪足较多，牢固附着在材料表面或深入孔洞内，形成细胞桥。M2组成骨细胞多呈不规则多边形，完全伸展，多个伪足牢固附着在材料表面及孔壁之上。

图3 种植体边缘MG63(×100);Fig 3 Morphology of MG63 in the surface of implants

2.4 各组材料对成骨细胞黏附率的影响

由表1可见，培养4 d后Sa、M1、M2组吸光度值均高于Sm组，差异有统计学意义(P＜0.05);Sa组与M1组之间差异不明显(P＞0.05);M2组与Sa、M1组相比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。培养8 d后，各组较4 d时黏附率均有所增加，Sa、M1、M2组吸光度值仍高于Sm;Sa组与M1组之间差异不明显(P＞0.05);M2组与Sa、M1之间差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

钛及钛合金因其良好的力学性能和生物相容性被广泛应用于牙种植体，现在用的钛种植体大多为全致密型，具有生物活性差、弹性模量与骨组织不匹配等缺点。这就导致了种植体植入后愈合时间较长，在这段时间里种植体容易松动、下沉和脱位，影响成功率［6］。因此制备出具有高生物活性的，弹性模量与骨组织相匹配的种植体成为种植义齿领域亟待解决的问题。

表面具有多孔结构的钛种植体能够有效降低材料的弹性模量，且粗糙多孔的表面结构能够促进细胞的黏附，而成骨细胞在种植体表面的黏附对种植体骨界面骨性结合的形成至关重要，因此制备出表面粗糙多孔的钛种植体成为国内外学者们的研究方向［7，8］。

具有粗糙表面的种植体与骨组织的结合面积及结合强度均大于光滑表面的种植体，而具有高孔隙度多孔结构材料因其开放性微孔及内部连通孔结构的存在亦有利于血管和神经长入，从而有利于骨性结合的形成［9］。本试验结果表明，无论4 d还是8 d，Sa、M1、M2组黏附率均高于Sm组，而M2组的黏附率又高于Sa、M1组，这一结果验证了高孔隙度且具有连通孔结构的种植体表面更有利于成骨细胞的增殖黏附。分析原因为:孔隙度高的材料增加了种植体的表面积，从而为成骨细胞的黏附增殖提供了足够的场所，因而增加了黏附率;孔隙度高的连通孔结构具有宽大的内部空间和表面积，有利于营养成分的渗透，代谢产物的排出，从而有利于成骨细胞的生长。

图4 联合培养8 d后各组成骨细胞黏附形态 (SEM，×1 000)Fig 4 The adhesion form of MG63 after cultured 8 d (SEM，×1 000)

表1 成骨细胞与材料联合培养4、8 d后各组吸光度值Tab 1 The OD value in 4 groups after cultured with MG63 for 4 d and 8 d

本研究中，由成骨细胞在各组材料表面不同的黏附形态分析可知:Sa、M1、M2组成骨细胞在黏附形态与定向生长两个方面均优于Sm组，说明粗糙的表面结构更有利于成骨细胞的黏附。这与大多国内外学者的研究结果相符。这是因为粗糙的表面结构能为成骨细胞的黏附提供更大的接触面积，而表面积与表面张力的乘积就是表面能，所以高孔隙度的种植体具有更高的表面能，Sergo等［10］发现高表面能对成骨细胞的吸附具有积极作用。Sa组与M1组在细胞形态上相仿，这可能由于二者在孔径与孔隙度上均相差不多有关。M2组成骨细胞在形态与定向生长两方面均优于Sa、M1组，分析原因是该组孔隙度较高存在开放性的微孔且SEM显示其内部具有连通孔结构。开放性的微孔对骨的内向生长是必需的，也使多孔支架基底广泛的体液交换成为可能。连通孔结构不仅为细胞的迁移和内向生长提供了更多的生长空间，同时因毛细血管的长入也有利于孔隙之间营养的交换、细胞外基质的沉积、氧气的进入及代谢产物的排出，而细胞外基质在以蛋白质为介导的细胞黏附机制［11，12］中起着决定性的作用。另外，连通孔结构具有更好的锁水作用，而亲水性表面更有利于细胞的黏附［13，14］。

粗糙多孔的种植体表面结构更有利于成骨细胞的黏附，而孔径和孔隙度在骨的定向生长中起关键性的作用。对于孔径的大小，大多学者通过理论研究及体内体外试验认为当孔径与成骨细胞(直径大约为30μm)直径大小相当或者大于成骨细胞直径时，有利于成骨细胞向孔内生长。试验中显示在孔径小于MG63的孔内，细胞无法内向生长，只能跨过孔隙平铺于表面;在孔径与MG63相似的孔内，细胞以伪足附着于孔壁，呈桥状生长;在孔径明显大于MG63的孔隙内，细胞以多个细长的伪足牢固附着于孔壁。在孔内可见细胞环形生长，部分呈垂直向生长。本试验结果与国内外学者的结论相符合［15，16］。而对于孔隙度，国内外研究尚存在争议。试验显示，对于采用MIM技术制备的多孔钛种植体，高孔隙度更有利于细胞的黏附，但孔隙度的增高必然造成材料强度的降低。如何调节材料的孔隙度和强度，使之达到临床上的最佳要求，还需要通过大量的后续试验加以研究。

多孔材料表面的孔径和孔隙度是影响成骨细胞黏附及骨性结合的最主要的参数。目前临床应用较广的喷砂制备方法既不能有效实现孔隙度和孔径可控，又不能形成对成骨细胞黏附极其重要的连通孔结构。MIM技术是一种从塑料注射成形行业中引申出来的新型粉末冶金近净成形技术。以它来制备多孔钛种植体可通过控制造孔剂的量调节孔隙度的大小，形成具有大孔径连通孔结构的不同孔隙度的多孔钛种植体，实现了孔隙度和孔径可控。它在成骨细胞的黏附率、黏附形态及生长方向各方面均优于目前临床应用较多的喷砂制备方法，为制备新型多孔钛种植体提供了理论依据。

［1］Cooper LF，Mawuda T，Yliheikkila PK，etal.Generalizations regarding the process and phenomenon of osseointegration.PartⅡ.In vivo studies［J］.Int J Oral Maxillofac Implant，1998，13(2):163－174.

［2］Anselme K.Osteoblast adhesion on biomaterials［J］.Biomaterals，2000，21(7):667－681.

［3］Kim HW，Noh YJ，Koh YH，etal.Effect of CaF2 on densification and propertied of hydroxyapatite-zirconia composites for biomedical applications［J］.Biomaterials，2002，23:4113－4121.

［4］Lim YJ，Oshida Y，Andres CJ，etal.Surface characterizations of variously treated titanium materials［J］.Int J Oral Maxillofac Implant，2001，16(3):333－342.

［5］Huang HH，Ho CT，Lee TH，etal.Effect of surface roughness of ground titanium on initial cell adhesion［J］.Biomol Eng，2004，21(3):93－97.

［6］Ryan G，Pandit A.Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications［J］.Biomaterials，2006，27:2651 –2670.

［7］Cardaropoli F，Alfieri V，Caiazzo F，etal.Manufacturing of porous biomaterials for dental implant applications through selective laser melting［J］.Adv Mater Res，2012，6(535－537):1222－1229.

［8］Allen C，Robert L，Tien-Mien G，etal.Development of niobium oxide coatings on sand-blasted titanium alloy dental implants［J］.Mater Sci Appl，2012，3:301－305.

［9］Li R，Clark AE，Hench LL.Effect of structure and surface area on bioactive powders made by sol-gel process［M］//Hench LL，West JK.Chemical Processing of Advanced Materials.New York:J Wiley and Sons，1992:627－633.

［10］Sergo V，Sbaizero O，David RC.Mechanical and chemical consequences of the residual stress in plasma sprayed hydroxyaptite coatings［J］.Biomaterials，2007，18(6):477－482.

［11］Iba K，Albrechtsen R，Gilpin B.The cysteine-rich domain of human ADAM 12 supports cell adhesion through syndecans and triggers signaling events that lead to betal integrin-dependent cell spreading［J］.JCell Biol，2000，149(5):1143－1156.

［12］李国英.材料及其制品表面加工新技术［M］.长沙:中南大学出版社，2003:1–92.

［13］Altankov G，Groth T.Reorganization of substratum-bound fibronectin on hydrophilic and hydrophobic materials is related to biocompatibility［J］.JMater Med，1994，5:732－737.

［14］St-Pierre JP，Gauthier M，Lefebvre LP，etal.Three-dimensional growth of differentiating MC3T3－E1 pre-osteoblasts on porous titanium scaffolds［J］.Biomaterials，2005，26:7319 – 7328.

［15］Anders P，Hakan E，Jukka L，etal.Commercially available dental implants:review of their surface characteristics［J］.J Biomater Tissue Eng，2012，2(2):112-124.

［16］Zinger O，Anselme K，Denzer A，etal.Time-dependent morphology and adhesion of osteoblastic cells on titanium model surfaces featuring scale-resolved topography［J］.Biomaterials，2004，25(14):2695－2711.