解耦联蛋白2在不同年龄大鼠脾、胸腺中的分布与表达

胡祥上 宫德正 易传安 邹 原 (怀化医学高等专科学校基础医学部，湖南 怀化 48000)

衰老又称老化，是指生物体在其生命的后期所进行的全身性、多方面、循序渐进的退化过程，这种退化过程在整体水平、组织细胞水平及分子水平均有体现〔1〕。实验研究表明，由于机体免疫功能随年龄下降，从而导致自身免疫疾病以及癌症发生的增多〔2〕。解耦联蛋白2(UCP2)属于线粒体内膜上质子转运家族中的成员之一，广泛表达于哺乳动物多种组织，其诱导质子漏的一个重要作用是减少线粒体ROS的产生。UCP2的高表达可预防氧化损伤，而抑制UCP2的表达则可在多种细胞类型中促进氧化损伤〔3〕。本研究拟观察不同年龄、生理状态下大鼠脾、胸腺组织中UCP2表达与ROS含量的关系，探讨UCP2在不同生理状态下抗脾、胸腺组织氧化损伤与细胞衰老及免疫功能的关系与作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠30只〔由大连医科大学动物实验中心提供，系清洁级动物，实验动物使用许可证号SYXK(辽)2002～0005〕，按年龄分为幼年组〔年龄21 d，体重(82±5)g〕、成年组〔年龄3个月，体重(181±12)g〕和老年组〔年龄18个月，体重(500±20)g〕，每组10只，不同组别动物分笼喂养，动物自由进食进水，室温，自然昼夜。实验室适应性喂养7 d后进行实验，术前禁食12 h。

1.2 主要试剂 UCP2山羊抗人多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)、HRP标记兔抗山羊IgG(Santa Cruz公司，美国)、生物素化兔抗山羊IgG(Santa Cruz公司，美国)、正常兔血清(北京中山生物技术有限公司)、浓缩型SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、丙二醛测定试剂盒、谷胱甘肽测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、ATP生物试剂盒(碧云天生物试剂公司)。

1.3 方法 ①脾、胸腺组织中MDA、GSH含量的测定:取脾、胸腺组织各0.5 g，分别加入4.5 ml PBS制成10%匀浆，3 000 r/min离心15 min后取上清。按试剂盒说明书操作，测定丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的含量。上述操作均在冰上进行，用Bradford法测定蛋白含量。②脾、胸腺指数测定:术前禁食、禁水12 h，将大鼠断头处死，采用无菌方法取脾脏和胸腺，用电子天平称重，并计算指数。③免疫组织化学方法检测大鼠脾、胸腺内UCP2蛋白的表达:分别取脾、胸腺组织大约1 cm×1 cm×1 cm，洗净血污，除去结缔组织。10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋切片(3～4 μm)，贴片(多聚赖氨酸挂片)后烤干。用SABC法进行免疫组织化学检测。常规脱蜡至水;3%过氧化氢甲醇室温孵育15 min，以消除内源性过氧化物酶反应;0.01 mol/L枸橼酸热修复抗原15 min;正常兔血清室温封闭30 min;羊抗UCP2(1∶150)4℃孵育过夜;生物素化兔抗羊IgG(1∶150)，室温孵育30 min;SABC 试剂(1∶100)室温孵育30 min;新鲜配制0.05%DAB(含0.01%H2O2)显色，适时用PBS终止反应。以上各步骤间均用PBS-T(0.01mol/L PBS，0.05%Tween-20，pH7.4)清洗切片5 min×4次。乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、光镜下检查并摄片。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件，实验数据以s表示，用t检验进行统计分析，组间差异的比较采用方差分析。

2 结果

2.1 不同年龄大鼠脾、胸腺组织内MDA含量的变化 MDA测定结果显示，老年组大鼠脾、胸腺组织中MDA含量〔(14.21±0.81)、(4.22 ±0.26)nmol/mg〕明显高于幼年组〔(13.18 ±2.38)、(2.35±1.05)nmol/mg〕和成年组〔(27.16±0.47)、(16.19 ±2.42)nmol/mg，P ＜0.01〕。

2.2 不同年龄大鼠脾、胸腺组织GSH含量的变化 不同年龄大鼠脾、胸腺组织GSH测定结果显示，GSH在老年大鼠脾组织中含量较成年大鼠及幼年大鼠显著下降〔(177.09±39.22)vs(285.36±5.01)、(378.85 ±43.23)mg/g，P ＜0.01〕，在老年大鼠胸腺组织中含量较幼年大鼠显著下降〔(114.61±1.75)vs(225.30±4.54)mg/g，P ＜0.01〕与成年大鼠无差异〔(120.36±14.93)mg/g，P ＞0.05〕。

2.3 不同年龄大鼠脾、胸腺指数的变化 不同年龄大鼠脾、胸腺指数测定结果显示，老年大鼠胸腺指数、脾指数均下降〔(16.19±3.42)、(0.85±0.02)mg/g〕。老年大鼠胸腺指数明显低于幼年组和成年组〔(2.35±1.05)、(0.32±0.04)mg/g，(4.22 ±0.26)、(0.24±0.06)mg/g，P ＜0.01〕。

2.4 不同年龄大鼠脾、胸腺实质细胞UCP2表达的变化 幼年组、成年组大鼠脾、胸腺实质细胞内UCP2表达较少(几乎无表达)，而老年组大鼠脾、胸腺实质细胞内UCP2表达较多。见图1。

图1 不同年龄组大鼠脾、胸腺细胞UCP2表达的免疫组织化学观察(DAB，×400)

3 讨论

MDA、GSH含量的变化 MDA、GSH含量的多少，均可以反映胸腺内活性氧(ROS)水平〔4，5〕。体内ROS的来源可分为内源性和外源性两方面，其中线粒体膜可产生各种各样的ROS。ROS除了通过氧化损伤对细胞造成直接损伤外，还能启动一系列的衰老信号传导途径，促进细胞衰老〔6〕。本实验结果表明老年大鼠脾、胸腺组织的抗氧化损伤能力降低。

随年龄的增长，机体的免疫功能发生紊乱并逐步衰退。有实验证实〔7〕，衰老使老年人及实验动物的免疫功能下降。衰老大鼠脾淋巴细胞的增殖能力及巨噬细胞的吞噬功能均明显下降〔8〕。IL-2和IL-6是反映机体免疫功能强弱的重要指标，IL-2主要由活化的T细胞产生，IL-6主要由单核巨噬细胞、T细胞、B细胞等产生的细胞因子。IL-2产生减少和IL-6水平异常升高均加速机体的衰老进程〔9，10〕。目前研究认为〔11〕，UCP2 可通过控制细胞ROS水平，反映在巨噬细胞介导的免疫起重要作用。本研究结果，在生理状态下随大鼠年龄的增长，脾、胸腺组织内ROS含量增多，ROS含量增多对 UCP2的表达有激活作用，UCP2的激活又反馈降低细胞内ROS的含量，从而延缓机体衰老，增强机体免疫功能。

研究显示〔12，13〕，在许多细胞内存在 UCP2-ROS 抗氧化系统，UCP2通过降低ROS产生，保护细胞免受ROS诱导的细胞凋亡。随动物年龄增加，体内ROS含量增多，ROS含量对UCP2表达有激活作用〔14〕;UCP2的激活又可以降低细胞内ROS的含量〔15〕。本结果发现老年组大鼠脾、胸腺实质细胞内UCP2表达较多，幼年组和成年组大鼠脾、胸腺实质细胞内UCP2表达较少(甚至无表达)。老年组大鼠脾、胸腺组织ROS增多，引发UCP2的表达增多;UCP2又可以降低ROS对细胞氧化损伤能力，从而对延缓机体由于细胞氧化损伤而引起的衰老有着积极意义。

目前，UCP2调节ROS的机制尚未完全明了，因此，UCP2与ROS、ROS与衰老之间调节及UCP2对免疫功能影响的作用机制有待进一步研究。

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