慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中Bach1和γ-GCS的表达

冯青青，夏熙郑

郑州大学第二附属医院呼吸内科 郑州 450014

氧化应激是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)重要的发病机制之一[1]。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是肺组织内重要的抗氧化剂，γ谷氨酸半胱胺酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)是合成GSH的限速酶，其在COPD氧化/抗氧化系统失衡中发挥重要作用[2]。BTB-CNC 异体同源体1(BTB and CNC homology 1，Bach1)是CNC转录因子家族成员之一，是一种亚铁血红素结合蛋白，广泛存在于人体内。研究[3]表明Bach1在大鼠COPD的发展中可能负向调节抗氧化基因γ-GCS的表达。作者通过观察稳定期COPD患者肺组织中Bach1、γ-GCS的表达水平，探讨两者在COPD发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1标本来源选取2011年3月至2012年5月因肺肿瘤于郑州大学第二附属医院胸外科行肺叶切除术的患者40例。患者术前均询问病史、体检、摄胸部X线片或CT、测肺功能等,凡符合中华医学会呼吸病学分会制定的COPD诊治指南[4]者入选COPD组,不符合者入选对照组。受检者均排除合并患有心、肝、肾等其他疾病，并排除支气管扩张、肺结核和其他可以影响肺功能的疾病。COPD组20例：男16例，女4例；年龄(63±10)岁；一秒用力呼气容积(FEV1)占预计值的百分比为(66.6±9.9)%,FEV1/FVC为(59.5±8.4)%；轻度16例,中度4例；左上肺7例,左下肺4例，右上肺5例，右下肺4例。对照组20例：男14例,女6例；年龄(58±9)岁；FEV1占预计值的百分比为(97.1±3.4)%,FEV1/FVC为(83.5±2.4)%；左上肺5例,左下肺4例，右上肺6例，右下肺5例。参照文献[5]，距肿瘤组织 4 cm以上处取材,多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片。

1.2肺组织中Bach1和γ-GCSmRNA的检测采用原位杂交法(ISH)检测。地高辛标记的多聚寡核苷酸探针(武汉博士德生物工程有限公司) 序列如下。Bach1:①5’-CAGACTCCTCAGTGTAAACTC CGCAGGTATCAAGG-3’。②5’-CACACATATGACCA ATATGGTGACTTGAATTTTGC-3’。③5’-AACGATGA TTATGTTTCAGAACCCCAGCAAGAACC-3’。γ-GCS:①5’-TGCACATCTACCACGCAGTCAAGGACCGGC-3’。②5’-ATATTCAGTCCACAAACTGGCAGACAATGA-3’。③5’-AGTACACGGAGCATAGACACCATCA-3’。严格按照原位杂交试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)说明书操作。以 PBS代替探针作阴性对照。胞质棕黄色染色为阳性表现。用显微显影系统(日本Olympus公司)采集图像,于肺泡及炎症细胞区各取5个视野(×400),利用多功能彩色细胞图像分析管理系统(上海山富科学仪器有限公司)计算阳性区的平均积分光密度，以此表示目的基因mRNA的表达水平。

1.3肺组织中Bach1和γ-GCS蛋白的检测采用免疫组化SP法检测，按试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)说明书操作。一抗用PBS稀释(Bach1抗体按100倍稀释，γ-GCS抗体按200倍稀释)，4 ℃过夜孵育一抗。 DAB显色,苏木精复染,脱水封片。以胞质中出现棕黄色染色为阳性表现。图像采集和分析同1.2。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行统计分析。2组肺组织中Bach1蛋白与γ-GCS mRNA、蛋白表达水平的比较采用两独立样本t检验, 采用直线相关分析对COPD组Bach1蛋白与γ-GCS mRNA、蛋白表达的相关性进行评价。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组肺组织中Bach1、γ-GCSmRNA和蛋白的表达COPD组和对照组患者肺组织中Bach1和γ-GCS mRNA均主要表达于肺泡上皮细胞和炎症细胞，平滑肌细胞中亦有少量表达。COPD 组Bach1和γ-GCS mRNA的表达水平均高于对照组(图1、表1) 。COPD 组患者肺组织中Bach1、γ-GCS蛋白均呈强阳性表达(图2)，表达水平较对照组明显升高(表1)。

图1 2组肺组织中Bach1、γ-GCS mRNA的表达(ISH, ×400)

表1 2组肺组织中Bach1、γ-GCS mRNA及蛋白表达水平的比较

2.2COPD组肺组织中Bach1与γ-GCS表达的相关性分析COPD组中Bach1 蛋白与γ-GCS mRNA、蛋白的表达均呈直线负相关(r为-0.834,-0.815,P<0.001)。

3 讨论

COPD是一种以不完全可逆的气流受限为特征的疾病，氧化/抗氧化系统失衡是其重要发病机制之一。γ-GCS是合成GSH的限速酶，是肺组织关键的抗氧化酶之一。γ-GCS基因表达和活性增高，进而增加GSH合成，可能是COPD抗氧化的主要机制之一[6]，但目前对于γ-GCS的调控机制尚不清楚。

Bach1是CNC家族的转录因子，在胞质、胞核中穿梭运动，调节氧化/抗氧化的动态平衡[7-9]。国外研究[7]表明， Bach1可与红系衍生核因子相关因子-2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)竞争抗氧化反应原件结合位点，下调抗氧化基因的表达，在体内抗氧化作用中起到负调控作用。王梅芳等[3]的实验结果表明在大鼠COPD的发展过程中Bach1可能对γ-GCS基因的表达起负调节作用。目前临床研究[10-13]表明，在COPD和肺气肿患者肺组织中Bach1、Nrf2处于失衡状态，同时Bach1水平升高。对于γ-GCS尚不能得到一致的结果[14-15]。作者发现，COPD患者肺组织中Bach1、γ-GCS mRNA及蛋白的表达均较对照组升高，且Bach1与γ-GCS mRNA的表达部位一致；相关分析结果提示COPD患者肺组织中Bach1蛋白与γ-GCS mRNA和蛋白的表达呈直线负相关。因此作者推测，在COPD的发展中，Bach1可能通过抑制γ-GCS基因的表达调控氧化/抗氧化系统。

总之，对Bach1和γ-GCS调控氧化/抗氧化系统的机制进行深入研究，有望为COPD的防治开辟新的途径。

[1] MacNee W. Pulmonary and systemic oxidant/antioxidant imbalance in chronic obstructive pulmonary disease[J].Proc Am Thorac Soc,2005，2(1)：50

[2] Ray S, Watkins DN, Misso NL,et al. Oxidant stress induces gamma- glutamylcysteine synthetase and glutathione synthesis in human bronchial epithelial NCI-H292 cells[J]. Clin Exp Allergy,2002,32(4): 571

[3] 王梅芳，戴爱国，胡瑞成，等.转录因子Nrf2/Bach1及MAPK激酶调控γ-GCS在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的作用[J].中国病理生理杂志，2009,25(5)：959

[4] 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组．慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007 年修订版)[J]．中华结核和呼吸杂志，2007，30(1):8

[5] 林书典，戴爱国，徐平． 慢性阻塞性肺疾病患者γ谷氨酰半胱氨酸合成酶活性及表达的变化[J]．中华结核和呼吸杂志，2005，28(2):97

[6] 陈林，戴爱国，胡瑞成．核因子相关因子2及其蛋白激酶与γ谷氨酰半胱氨酸合成酶在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织的表达[J]．中华结核和呼吸杂志，2006，29(7):487

[7] Reichard JF，Motz GT，Puga A．Heme oxygenase-1 induction by NRF2 requires inactivation of the transcriptional repressor BACHI[J]．Nucleic Acids Res，2007，35(21):7074

[8] Dhakshinamoorthy S，Jain AK，Bloom DA，et al．Bach1 competes with Nrf2 leading to negative regulation of the antioxidant response element(ARE)-mediated NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1 gene expression and induction in response to antioxidants[J].J Biol Chem，2005，280(17):16891

[9] Shan Y，Lambreeht RW，Donohue SE，et al．Role of Bach1 and Nrf2 in up-regulation of the heme oxygenase-1 gene by cobalt protoporphyrin[J]. FASEB J，2006，20(14)：2651

[10] Malhotra D，Thimmulappa R，Navas-Acien A,et al. Decline in NRF2-regulated antioxidants in chronic obstructive pulmonary disease lungs due to loss of its positive regulator,DJ-1[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2008, 178(6): 592

[11] Singh A，Ling GY，Suhasini AN,et al. Nrf2-dependent sulfiredoxin-1 expression protects against cigarette smoke-induced oxidative stress in lungs[J]. Free Radic Biol Med, 2009，46(3):376

[12]Suzuki M，Betsuyaku T，Ito Y,et al. Down-regulated NF-E2-related factor 2 in pulmonary macrophages of aged smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2008, 39(6):673

[13]Goven D，Boutten A，Lecon-Malas V,et al. Altered Nrf2/Keap1-Bach1 equilibrium in pulmonary emphysema[J]. Thorax,2008,63(10): 916

[14]Rahman I, van Schadewijk AA, Hiemstra PS, et al. Localization of gamma-glutamylcysteine synthetase messenger rna expression in lungs of smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Free Radic Biol Med,2000,28(6):920

[15]Harju T,Kaarteenaho-Wiik R, Soini Y,et al.Diminished immunoreactivity of gamma-glutamylcysteine synthetase in the airways of smokers’ lung[J]. Am J Respir Crit Care Med,2002,166(5):754