肝癌细胞中C60含量的荧光分析法测定*

姚寒春，孙 敏，张振中

郑州大学药学院 郑州 450001

C60又称富勒烯，是碳的第三种同素异形体。C60是完全由碳组成的中空球体，呈椭圆形或管形，表面含有20个六边形和12个五边形，共有60个顶点，在物理及化学性质上可看作三维的芳香化合物[1-2]。C60在医药方面有许多重要的应用，极易吸附在肝癌细胞的表面并进入肝癌细胞内部[3]。随着在生物医药领域中的广泛应用，C60不可避免地会在生物体内累积，对生物体产生一定的毒害损伤[4-5]。因此，分析测定肝癌细胞中C60含量具有重要意义。有关C60含量测定的报道大多采用色谱方法应用于环境和材料领域[6]，关于生物样品中的检测报道很少[7]。Sene等[8]采用荧光分光光度法，基于C60颗粒的光散射性质，对水溶液中的C60颗粒进行定量，检测限达到0.009 mg/L。作者基于C60自身的荧光性质和无需化学修饰的特点，采用荧光分光光度法测定了肝癌细胞中C60含量，报道如下。

1 材料与方法

1.1主要仪器与试剂①荧光分光光度计(日本岛津RF-5301PC)，JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，LH50A型倒置显微镜(日本Olympus公司)，超低温保存箱(日本SANYO公司)，LE-80K型超高速离心机(美国Beckman公司)。②C60(河南濮阳永新科技有限公司，纯度99.9%)，泊洛沙姆F68(德国BASF公司)，含双抗的RPMI 1640培养基及胰蛋白酶(美国Gibco公司)，肝癌细胞(郑州大学药学院)，胎牛血清(天津TBD公司)，体积分数75%医用乙醇(分析纯，天津四友化学试剂有限公司)，实验用水为超纯水。

1.2溶液制备

1.2.1 C60分散液的制备 精确称取C60粉末适量至5 mL具塞离心管中，加入2 mL 的泊洛沙姆F68(10 g/L)溶液，涡旋5 min，60 ℃水浴超声2 h后，连接于超声波细胞粉碎仪上，调整工作时间为6 s，间隔时间为8 s，工作次数为10次，并调节工作压力至400 W，进行超声处理。最后，将溶液以5 000 r/min离心5 min取上清，得到C60分散液。

1.2.2 肝癌细胞裂解液的制备 肝癌细胞经过传代，在细胞培养箱中培养24 h，然后在细胞培养瓶中贴壁，贴壁面积为70%～80%时用PBS冲洗干净，以2.5 g/L胰酶消化5 min(37 ℃)，收集消化液以1 000 r/min离心5 min。弃上清，加入5 mL PBS，用细胞计数板计数肝癌细胞，然后置于超声细胞粉碎仪上，以400 W的工作压力破碎细胞，4 000 r/min离心10 min取上清，得到肝癌细胞裂解液。

1.2.3 C60-肝癌细胞裂解液的制备 在肝癌细胞生长80%～90%左右加入961.58 mg/L 的C60分散液1.8 mL，作用24 h后，按1.2.2项处理肝癌细胞，得到C60-肝癌细胞裂解液。

1.3C60与肝癌细胞作用时间的考察肝癌细胞经传代后生长至70%左右，加入C60分散液，置于CO2培养箱中培养，分别于培养0、12、24及48 h后于倒置显微镜下观察肝癌细胞形态。

1.4C60荧光分光光度法测定实验考察了220～900 nm波长范围内不同质量浓度C60分散液的激发和发射光谱，见图1。结果表明C60分散液的最佳激发波长为220 nm，最大发射波长为371 nm，因此选择371 nm作为C60含量测定波长。

图1 C60分散液的荧光图谱

1.5方法学考察

1.5.1 线性关系 取C60分散液5、10、20、50、150及180 μL，用肝癌细胞裂解液(1×104mL-1)稀释，配制成质量浓度分别为1.28、2.56、5.12、12.80、38.40及46.08 mg/L的标准液，以220 nm为激发波长，在371 nm发射波长处测定标准液荧光强度。以C60质量浓度C为横坐标，荧光强度I为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程。

1.5.2 精密度实验 将C60分散液用肝癌细胞裂解液稀释，配制成2.56、25.57和46.08 mg/L的样品溶液，用荧光分光光度法测定其荧光强度。每个样品日内重复测定5次，连续测定3 d，考察其日内和日间精密度。

1.5.3 回收率实验 在一定质量浓度的C60-肝癌细胞裂解液样品中分别加入C60分散液50、90及110 μL，测定样品的荧光强度，按照标准曲线计算出C60含量及回收率。

1.6样品含量测定吸取0.25 mL C60-肝癌细胞裂解液样品3份，用超纯水稀释至3 mL(肝癌细胞数 1×104mL-1)，每份样品平行测定荧光强度3次，取平均值，按照标准曲线计算C60含量。

2 结果

2.1样品溶液的荧光图谱在所选实验条件下，C60分散液、肝癌细胞裂解液以及C60-肝癌细胞裂解液的荧光图谱见图2。由图2可知，肝癌细胞内源性物质对C60分散液的荧光测定无干扰。

2.2C60作用不同时间对肝癌细胞形态的影响肝癌细胞与C60分散液作用0、12、24及48 h后的细胞形态见图3。可以看出，培养24 h后，肝癌细胞有70%存活，生长状态较为良好；48 h时，由于没有新鲜的培养基，肝癌细胞开始出现死亡，所以在制备C60-肝癌细胞裂解液时，选择作用24 h的细胞。

图2 样品溶液的荧光图谱

A：C60-肝癌细胞裂解液；B：C60分散液；C：肝癌细胞裂解液。

图3 C60分散液作用0、12、24及48 h后肝癌细胞的形态

A～D：分别为C60作用0、12、24及48 h后肝癌细胞的形态；E：普通显微镜下C60作用24 h后肺癌细胞的形态；F：荧光显微镜下C60作用24 h后肝癌细胞的形态。

2.3方法学考察结果

2.3.1 线性关系及精密度 在所选实验条件下得到的标准曲线为：I=2.240 3C+44.188(r=0.995 8，P<0.05)；C60质量浓度在1.28～46.08 mg/L范围内线性关系良好。根据S/N为3计算，得到检测限为0.275 mg/L。精密度实验结果较为满意，见表1。

表1 肝癌细胞中C60测定的精密度实验结果(n=5)

2.3.2 回收率及样品分析 回收率实验结果见表2。由表2可知，该方法测定C60的平均回收率为86.5%，RSD为10.8%。按照标准曲线计算，3份C60-肝癌细胞裂解液样品中C60的平均含量为9.27 mg/L。

表2 肝癌细胞裂解液中C60测定的回收率实验结果

3 讨论

该实验与以往报道的方法不同的是使用表面活性剂泊洛沙姆将C60分散在水溶液中，而不是采用甲苯等有机溶剂[9-10]。泊洛沙姆对肝癌细胞影响较小，实验能真实反映肝癌细胞正常状态下的摄取量。该实验通过四因素三水平正交实验考察了泊洛沙姆溶液浓度、泊洛沙姆溶液与C60粉末碳超功率、离心转数及时间的影响，结果表明，泊洛沙姆溶液浓度为10 g/L，碳超功率为400 W，以5 000 r/min 离心5 min为最佳实验条件。

C60分散液发射光谱在371 nm，培养基以及胰酶会对其荧光产生干扰，而PBS对C60分散液的荧光测定没有干扰，所以该实验中通过加入PBS代替培养基，胰酶消化肝癌细胞，以4 000 r/min 离心的方法去除培养基、胰酶的干扰。肝癌细胞中的蛋白、氨基酸发光以及肝癌细胞聚沉均会对C60的荧光测定产生影响。实验中将肝癌细胞进行破碎，离心取上清，减小了肝癌细胞胞内物质对C60测定的影响。

作者利用C60本身发射荧光的性质，建立了测定肝癌细胞中C60含量的荧光分析法。方法学考察结果表明，该方法简单、快速、准确度高，为今后生物样品中C60的检测提供了一个新的选择。

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