虚拟模板分子印迹固相萃取-高效液相色谱法检测果蔬中三唑类杀菌剂

刘 博，尹 航，高文惠

(河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050018)

杀菌剂的使用在中国农业种植过程中担当了越来越重要的作用，使用量和使用面积逐年增加。烯唑醇和戊唑醇属于三唑类杀菌剂。这类杀菌剂具有高效、广谱、内吸性的特点，其防治病菌的机理主要是它们能抑制菌体细胞膜上麦角甾醇的去甲基化，从而使病菌无法形成细胞膜，进而杀死病菌。这些三唑类杀菌剂对生物体有以下危害：1)损害神经系统；2)使机体的生殖机能下降或产生异常现象；3)降低生物体的免疫能力并诱发肿瘤。

分子印迹技术现在越来越多地被用于食品中有害物质的检测中，主要研究内容有新模板物质开发[1-2]、功能单体选择等。近几年分子印迹技术得到了快速发展，主要因为分子印迹技术具有特异性选择、可反复使用、耐苛刻条件、简化前处理、制作简单等优点[3]。其广泛应用于化学仿生传感器[4-6]、模拟酶催化[7-10]、固相萃取技术[11-21]等领域。

虚拟模板技术是利用与目标物结构类似的模板物质进行合成，利用所得聚合物对目标物质分离富集。采用虚拟模板技术合成分子印迹聚合物有效地降低了合成过程中的毒性和成本，还能避免模板泄露导致的定量不准确问题，而又能达到对目标物的高吸附效果[1]。

本文采用本体聚合法自制了联苯三唑醇分子印迹聚合物(MIP)，以此聚合物为固相萃取剂，制备固相萃取柱，对果蔬中烯唑醇、戊唑醇进行分离富集，并采用高效液相色谱法测定其在果蔬中的残留。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

联苯三唑醇(纯度为99%，上海酶联生物科技有限公司提供)；烯唑醇(纯度为98%，北京金宝在线科技有限公司提供)；戊唑醇(纯度为98%，北京金宝在线科技有限公司提供)；甲醇、乙腈(色谱纯，天津市光复精细化工研究所提供)；α-甲基丙烯酸酯(MAA，分析纯，天津市化学试剂一厂提供，使用前需要重蒸以除去阻聚剂)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，分析纯，抚顺安信化学有限公司提供)；偶氮二异丁腈(AIBN，化学纯，天津市大茂化学试剂厂提供)。

LC-20A高效液相色谱仪，配紫外检测器(日本岛津公司提供)；SHZ-82A型恒温水浴振荡器(江苏省太仓医疗器械厂提供)；ASE-12固相萃取仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司提供)；KH5200型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司提供)。

1.2 分子印迹聚合物制备

实验室自制分子印迹聚合物：将0.2 mmol联苯三唑醇和0.8 mmol的α-甲基丙烯酸酯(MAA)放入50 mL的安瓿瓶中，加致孔剂使其反应，超声1 h，振荡30 min后，再加交联剂EDMA和引发剂AIBN。超声30 min，混匀后通入N2脱氧15 min后，抽真空1 min后密封，在恒温水浴振荡器中振荡24 h，得块状固体MIP。经研磨、粉碎，过200目(75 μm)筛，再用去离子水沉降聚合物3次除去过细粉末。将最终得到的MIP颗粒用甲醇-乙腈(体积比为95∶5)洗脱至无模板分子，最后用甲醇浸泡1 h除去残留的乙酸，洗脱后的聚合物放入真空干燥器中(45 ℃)干燥6 h，得到联苯三唑醇模板聚合物MIP。

1.3 固相萃取柱制备

将研磨后过200目(75 μm)筛的分子印迹聚合物装填入内径为1.5 cm、长为15 cm的具砂芯层析管，层析管有效分离区域高2 cm，在上端加2 cm高的脱脂棉，轻轻挤压使柱子填充紧实。

1.4 色谱条件

色谱柱：安捷伦C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，检测波长为230 nm，流动相为甲醇-水(体积比为70∶30)，流速为1 mL/min，柱温箱温度为25 ℃，进样量为20 μL。

1.5 样品前处理

分别称取5.00 g苹果和白菜样品，捣碎，加6 g无水硫酸钠，用20 mL乙腈溶解，混匀，超声15 min，于4 000 r/min离心10 min，吸取上清液过分子印迹固相萃取柱，用三蒸水20 mL淋洗，待排净淋洗液后，用10 mL甲醇洗脱[19]，收集洗脱液待检。

2 结果与讨论

2.1 分子印迹固相萃取柱对样品净化和检测效果

分子印迹固相萃取柱利用非共价键对目标物吸附，通过淋洗液将杂质去除，最后利用洗脱液将目标物洗脱下来。淋洗液的量对样品净化起到至关重要的作用，若淋洗液量少，会导致洗脱后洗脱液的液相色谱图出峰复杂，干扰分析。分别测试了5～20 mL 4个淋洗液用量，结果发现20 mL淋洗液可将杂质全部洗去。从图1和图2对比可知联苯三唑醇分子印迹固相萃取柱对样品净化效果明显。从图3可知，其对结构类似物烯唑醇和戊唑醇具有选择性的吸附作用，从而表现了它从复杂基质条件下分离富集目标物的优越性能。

图1 苹果原液色谱图Fig.1 Sample chromatograms of apples stock solution

图2 苹果样品过柱后色谱图Fig.2 Chromatograms of effluent aftersample cross SPE column

1-戊唑醇；2-烯唑醇图3 苹果加戊唑醇和烯唑醇后过柱洗脱液色谱图Fig.3 Sample solution added standard after passing SPE column

2.2 分子印迹聚合物对结构类似物的识别作用

由于形成分子印迹聚合物的模板物质联苯三唑醇分子中存在着带有孤对电子的N原子，其电负性较大，能和羧基中的H原子形成氢键，由此可推测模板分子与功能单体MAA的作用形式。烯唑醇和戊唑醇以及联苯三唑醇都属于三唑类杀菌剂，它们在结构上都有三唑环，有带孤对电子的N原子，化学结构式类似(见图4)，所以联苯三唑醇分子印迹聚合物能够对烯唑醇和戊唑醇吸附，形成非共价键结合而产生识别作用。

图4 化学结构式Fig.4 Chemical structural formula

2.3 线性范围与检测限

将烯唑醇和戊唑醇分别配制成质量浓度为0.25，0.5，1，2，5，10，20，50，100，200 μg/mL的一系列标准溶液，在1.4色谱条件下绘制烯唑醇和戊唑醇的线性关系曲线，其线性关系和检测限见表1。

表1 烯唑醇和戊唑醇的线性关系及检测限Tab.1 Linear equation and detection limit of tebuconazole and diniconazole

2.4 方法回收率和精密度

采用本方法对果蔬样品在10 μg/g和为100 μg/g 2个烯唑醇和戊唑醇添加水平下，进行加标回收率实验，分析结果如表2所示，烯唑醇平均回收率为74.6%～88.6%，相对标准偏差(RSD)为2.0%～3.7%(n=5)。戊唑醇平均回收率为66.9%～73.3%，相对标准偏差(RSD)为1.2%～3.1%(n=5)。说明方法的回收率和精密度良好。

表2 果蔬的回收率实验(n=5)Tab.2 Recovery of fruit and vegetable(n=5)

3 结 论

采用本体聚合法自制了联苯三唑醇分子印迹聚合物(MIP)，以此聚合物为固相萃取剂，制备固相萃取柱，对果蔬中烯唑醇和戊唑醇进行分离富集，并采用高效液相色谱法测定其在果蔬中的残留。结果表明，利用此印迹聚合物对样品进行前处理，其净化效果好。烯唑醇线性范围为1～200 μg/mL，线性相关系数r=0.999 9，样品平均回收率为74.6%～88.6%，相对标准偏差(RSD)为2.0%～3.7%(n=5)，检测限为0.5 μg/mL。戊唑醇线性范围为0.5～200 μg/mL，线性相关系数r=0.999 8，样品平均回收率为66.9%～73.3%，相对标准偏差(RSD)为1.2%～3.1%(n=5)，检测限为0.25 μg/mL。

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