太极拳运动后白细胞Th1/Th2 型细胞因子mRNA 的表达

杨德洪，魏 勇

研究显示，随着增龄老年人易出现T 淋巴细胞克隆向Th1 亚群分化［1］，进而出现Th1 型细胞因子分泌增多，抑制Th2 型细胞因子的分泌，即所谓的Thl/Th2极化现象，从而破坏了Thl/Th2 平衡在机体免疫防御反应的调节中所具有关键性作用，导致糖尿病、肿瘤和自身免疫性疾病等发病率增加。大量研究也证实，太极拳运动可以延缓衰老，减少老年性疾病的发生率，提高生活质量［2］，但其确切机制目前尚不清。本研究旨在检测太极拳运动的不同时段Thl/Th2 型细胞因子mRNA 的表达情况，并进一步了解太极拳运动对Th1/Th2 型细胞因子平衡的影响，探讨太极拳健身的可能免疫学机制。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

自愿参加本次测试的中老年女性21 人，年龄在50～65岁之间，均为近期无运动习惯的太极拳运动的初学者。临床医学检查均排除高血压、冠心病、肿瘤、神经、精神类疾病及其他慢性消耗性疾病和影响HSP70 表达的有关因素。研究对象的基本情况见表1。

表1 研究对象基本情况(Mean±SD)

1.2 研究方法

1.2.1 训练计划

1)运动项目:以学练国际推广套路48 式太极拳为项目内容。

2)运动强度:采用遥测心率仪对运动强度进行监控。每月调整一次强度，通过改变练习时重心高度、练习间歇时间调节运动强度，使强度位于靶心率之间。靶心率计算公式:靶心率=60%～80% ×(220－年龄)

3)运动时间和频率:每次练习持续1～1.5 小时，每周练习3 次(隔天一次)，实验周期共6 个月(2004年10月～2005年3月)。

整个太极拳学习和训练过程由专人进行指导。

1.2.2 取材

分别于实验前、运动后第3 个月、第6 个月的晨7:30－8:00 对各受试者进行样品采集。抽肘静脉血2 ml 全血注入肝素(10 U/ml)抗凝试管，然后立即离心(1 500 rpm，10 min)。以红细胞裂解液溶解全血中的红细胞后，转至1.5 ml eppendorf 管中，制备成白细胞沉淀保存于－80℃冰箱备用。

1.2.3 细胞因子mRNA 检测

1.2.3.1 抽提RNA 合成cDNA 使用经典法RNA 抽提试剂盒从白细胞沉淀中抽提总RNA (试剂盒由上海申能博采生物科技有限公司提供)。按照RevertAidTM 第一链cDNA 合成试剂盒把2 μg RNA 用作模板合成cDNA(试剂盒购自立陶宛MBI Fermentas 公司)。在0.2 ml effendorf 管中进行反转录，反应总体积20 μl。合成的cDNA 储存在－20℃备用。

1.2.3.2 实时定量PCR 检测 根据Genbank 数据库中公开发表的基因序列，设计INF－γ、IL－2、IL－4、IL－10 和GAPDH 的引物和探针，见表2。各探针在两端分别具有报告基团6－羧基荧光素(6－carboxyfluorescein，6－FAM)(位于5＇端)，和淬灭基团6－羧基－四甲基罗丹明(6－ carboxy－ tetramethyl－ rhodamine，TAMRA)(位于3＇端)。

表2 INF－γ、IL－2、IL－4、GAPDH 的引物和探针

定量PCR 检测在Rotor－Gene RG 3000 (Corbett，Australia)荧光PCR 仪上进行。定量PCR 反应液包含:10 × PCR 反应缓冲液2.5 μl，25 mM MgCl21.5 μl，上游及下游引物(400μM)各0.1 μl，0.1μl 荧光素标记探针(50 μM)，10 mM dNTP 0.5 μl，0.5μl Taq DNA 酶(1.25 units)，2 μl cDNA，DEPC－H20 17.7 μl。上述反应液可保存于－20℃。定量PCR 反应条件:50℃预热300 s;95℃变性300 s;95℃20 s，60℃60 s，40 个循环，每个循环在60℃时检测荧光强度。根据标准曲线计算每个基因的拷贝数。

1.2.4 统计学处理

所有实验测试指标均表示为Mean± SD，采用SPSS11.0 统计软件包对数据进行处理。显著性标准以P ＜0.05 为有显著性差异，P ＜0.01 为有非常显著性差异。

2 实验结果

2.1 6 个月太极拳运动干预后外周血白细胞INF－γ mRNA、IL－4 mRNA 的变化

经过太极拳运动干预，中老年妇女外周血白细胞INF－γ mRNA 的表达量逐渐降低，3、6月时表达量均与干预前相比存在明显差异。IL－4 mRNA 表达量先降低后回升，但仍未达初始水平，且3月时的表达量与干预前相比存在显著性差异(表3)。

表3 白细胞INF－γ mRNA、IL－4 mRNA的变化(Mean±SD，n=21)

2.2 6 个月太极拳运动干预后外周血白细胞INF－γ mRNA/IL－4 mRNA 的变化

经过太极拳运动干预，中老年妇女外周血白细胞INF－γ mRNA 与IL－4 mRNA 比值逐渐降低，与干预6月相比干预前和干预3月均存在明显差异(如表4)。

表4 白细胞INF－γ mRNA 与IL－4 mRNA 比值的变化

3 分析与讨论

Thl/Th2 细胞的调节对维持机体正常的免疫功能至关重要［3］。在生理条件下，机体Th1/Th2 细胞的免疫功能处于动态平衡状态，一旦这种平衡发生偏离，机体就会趋向疾病状态。当Th1 细胞占优势时，机体可产生细胞免疫亢进相关性疾病，当Th2 细胞占优势时，机体可发生体液免疫亢进相关性疾病。Th1 和Th2 细胞因子所诱导的免疫反应又可相互调节或交叉调节［4］。因此，Thl/Th2 的失衡与自身免疫病、过敏性疾病、肿瘤、移植排斥反应以及感染性疾病的发生发展有密切的关系。一般Thl 细胞可分泌IFN－γ 而不分泌IL－4，Th2 细胞可分泌IL－4 而不分泌IFN－γ，通常以这两种细胞因子作为鉴别Thl、Th2 的标志。

3.1 衰老与Th1/Th2 型细胞因子表达

以往检测细胞因子多通过培养和丝裂原刺激方式，从蛋白水平观察细胞因子，显示的是细胞对刺激的反应能力而未必能完全反映机体当时细胞因子的表达状况。如欲客观反映机体免疫调节和机能状况，尚需在无任何刺激的状态下检测自发性细胞因子mRNA的基因表达水平。

荧光实时定量PCR 的问世为检测细胞中微量自发性Th1/Th2 特征性细胞因子mRNA 的表达提供了技术保障。根据Taqman 技术对靶基因mRNA 表达进行定量分析是近年来发展起来的一项新技术［5］，其原理是将靶基因特异性的一组引物和荧光标记探针与模板cDNA 进行杂交，然后在多聚酶链反应过程中利用Taq 酶的3’－核酸外切酶活性水解探针3’段的荧光淬灭基团，获得荧光激发信号，后者与模板量呈正相关。通常将这种荧光实时定量PCR 分为相对定量和绝对定量两类。相对定量分析以靶基因阳性表达的细胞作为标准，通过分析靶基因与内参照基因(如GAPDH 等)的比值，获得待测样本中靶基因表达的相对值。这种方法的优点是容易开发，但所得的数值受阳性标准细胞的影响，不同的实验室若采用不同的阳性细胞作为标准，则结果难以相互比较。绝对定量是采用拷贝数已知的DNA 片断作为标准，该片断可采用基因克隆或PCR 扩增获得。由于绝对定量检测是以一种可以标准化的DNA 参照物作为基准，因而不同实验室的检测结果具有可比性。绝对定量PCR 检测技术是定量PCR 的发展方向。

本研究采用陈佩杰教授自主研发的实时定量PCR 细胞因子检测专利技术［6］，对健康中老年妇女外周血白细胞的自发性Th1/Th2 细胞因子的基因表达进行了实时定量的观测。结果发现健康中老年妇女确实存在自发性细胞因子的基因表达，进一步证实该项技术能够评价生理状态下免疫细胞的细胞因子表达。

研究显示，随增龄细胞因子网络发生了复杂的变化，一些细胞因子生成减少(如IL－2)，而另一些细胞因子产生增多(如IL－1、IL－6 和TNF－α)，其中主要是Thl 型细胞因子向Th2 型细胞因子的转化［7］和炎症性细胞因子产生增多。但是Sakata 等研究发现老年人外周血CD4 +T 细胞产生IFN－γ 的水平高于年轻组，而IL－4 水平降低，提示老年个体有Thl 的极化现象［1］。对于健康中老年人而言，由于衰老而出现的Th1/Th2 极化方向目前尚没有定论。本研究结果显示，健康中老年妇女在未接受任何干预时外周血白细胞IFN－γmRNA 和IL－4 mRNA 的比值为0.5589±0.012。由于目前没有公认的健康人群Th1/Th2 细胞因子平衡的标准，本研究也没有涉及不同年龄组之间的比较，因此，仅凭此结果还不能判断本研究的中老年妇女是否存在Th1/Th2 极化现象以及极化方向。

3.2 太极拳运动对Th1/Th2 平衡的影响

运动对Th1/Th2 淋巴细胞因子影响的研究很少。Moyna 等［8］研究了平时经常活动和活动很少的男性和女性在递增负荷运动后血清Th1/Th2 代表性细胞因子的变化，结果证实运动能够改变Th1/Th2 平衡。

Suzuki K 等［9］研究发现，力竭运动可以导致Th1/Th2 平衡向Th2 偏移。与此不同的是，Lancaster GI等［10］的研究发现运动后即刻和恢复期Th1 型淋巴细胞在循环中的百分比和数目以及其代表性细胞因子IFN－γ 均明显下降，但Th2 淋巴细胞及其代表性细胞因子IL－4 却没有明显变化。Steensberg A［11］等的研究也发现运动后即刻和2 小时循环血中的Th1 细胞比例被抑制，而Th2 细胞比例没有变化。Kohut ML［12］等却发现运动可以增加Th1 相关细胞因子IL－1 和IFN－γ，而对Th2 相关细胞因子IL－10 没有影响。分析这些不一致的研究结果，可能与各研究的研究对象、运动强度、运动持续时间等有关。

本研究显示太极拳运动后中老年妇女外周血白细胞INF－γ mRNA 的表达量逐渐降低，3、6月时表达量均与干预前相比存在明显差异。IL－4 mRNA 表达量先降低后回升，但仍未达初始水平，且3月时的表达量与干预前相比存在显著性差异。而INF－γ mRNA 与IL－4 mRNA 比值逐渐降低，与干预6月相比干预前和干预3月均存在明显差异。考虑到本研究的实验对象为太极拳初学者，前3 个月的太极拳锻炼对机体的应激不大，所以从第6月和运动前相比，其结果更能反映太极拳运动的影响。因此，本研究的结果可以简化为INF－γ mRNA 下降明显，IL－4 mRNA 没有明显变化，INF－γ mRNA 与IL－4 mRNA 比值下降明显，提示太极拳运动使中老年妇女Th1/Th2 向Th2 极化，这一结果与文献［9－11］相似。

运动影响Th1/Th2 平衡的机理还不明确。Elenkov IJ［13－14］通过分析文献认为，运动所致的糖皮质激素和儿茶酚胺等应激激素可能会选择性地抑制Th1 细胞免疫轴，使得机体免疫机能向Th2 介导的体液免疫偏移。太极拳影响Th1/Th2 细胞因子的机理可能也与运动后激素分泌以及与免疫系统的相互作用有关，但确切机制还有待进一步验证。

3.3 中老年妇女太极拳运动后Th1/Th2 变化的可能意义

研究显示，随着增龄，老年人易出现T 淋巴细胞克隆向Th1 亚群分化［1］，进而出现Th1 型细胞因子分泌增多，抑制Th2 型细胞因子的分泌，即所谓的Thl/Th2 极化现象，从而破坏了Thl/Th2 平衡在机体免疫防御反应的调节中所具有关键性作用，导致糖尿病、肿瘤和自身免疫性疾病等发病率增加。

从细胞整体水平而言，细胞因子谱有Thl 或Th2型细胞因子占优势的格局，这提示特定的细胞因子在特定的体内环境下会发生相对优势转化，正是这种转化满足了机体对不同抗原刺激应答的实际需要［15］。如果能人为地选择性诱导或调控Th1/Th2 细胞的免疫反应，促使Th1/Th2 细胞反应的动态平衡，则将十分有利于疾病转归。这应该是应用各种方法调整衰老机体体内Thl/Th2 平衡以延缓衰老，减少老年相关疾病发病率的理论基础。邓阳勇等［16］的研究证实了这一方法的可行性。他们通过芦荟多糖调节衰老模型小鼠Th1/Th2 细胞因子失衡，使其偏移逆转，则减少了老年性疾病的发生，延缓了衰老。

大量研究也证实，太极拳可以延缓衰老，减少老年性疾病的发生率，提高生活质量，但其确切机制目前尚不清。本研究结果显示经过太极拳运动干预后INF－γ mRNA 下降明显，IL－4 mRNA 没有明显变化，INFγ mRNA 与IL－4 mRNA 比值下降明显，提示太极拳运动使中老年妇女Th1/Th2 向Th2 极化。Sakata－Kaneko S［1］的研究证实，衰老使老年人Th1 型细胞因子分泌增多，抑制Th2 型细胞因子的分泌，即所谓的Thl/Th2 向Thl 极化现象。结合这一结果，作者认为太极拳运动使衰老个体Thl 极化的细胞因子分泌逆转，从而使衰老机体Th1/Th2 细胞反应重新回归动态平衡。进一步提示，太极拳运动调节机体的Thl/Th2 型细胞因子的平衡也许是太极拳调节中老年机体免疫力，增强健身效果的可能机制，但这还有待实验研究予以验证。

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