多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡萝卜素的生产

赵婧，刘怡，李清艳，朱欣娜，张学礼

1 天津科技大学生物工程学院，天津 310018

2 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308

3 中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津 300308

β-胡萝卜素属于类胡萝卜素家族的一员，在药品、保健品、化妆品和食品上有广泛的应用[1-2]。尽管目前市场上销售的 β-胡萝卜素 90%是通过化学合成法获得，但随着国内外对天然β-胡萝卜素市场需求的增加，采用微生物发酵法生产具有广阔的应用前景[2-3]。很多天然微生物都能合成β-胡萝卜素，例如三孢布拉氏霉菌 Blakeslea trispora、成团泛菌 Pantoea agglomerans等[4]。由于类胡萝卜素合成途径相关基因已经解释清楚，大肠杆菌遗传背景清晰、操作简单，以大肠杆菌作为出发菌株，运用代谢工程手段构建产类胡萝卜素基因工程高产菌株，成为包括β-胡萝卜素在内的多种类胡萝卜素产品开发的新生产途径[1-3,5-6]。

异戊烯焦磷酸 (IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸酯 (DMAPP)是类胡萝卜素来源的两个通用前体。目前已知有两种合成途径：一种是甲羟戊酸 (Mevalonate)途径MVA，主要存在于古生菌、真菌和植物的胞液或内质网上；另一种是 MEP(2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸)途径，主要存在于细菌和植物质体中[7](图 1)。Yoon等进行了MVA途经合成β-胡萝卜素的研究，他们将MVA途经的下游3个基因和β-胡萝卜素合成相关基因以质粒形式在大肠杆菌表达，有效提高了β-胡萝卜素的产量，在外源添加甲羟戊酸的情况下，产量达503 mg/L，单位细胞含量达49.3 mg/g干重细胞。但外源基因的高水平表达抑制了细胞的生长，并且存在重组细胞不稳定的缺点[1-3]。多个研究小组采用了在染色体上用强启动子调控关键基因表达强度的策略来实现提高类胡萝卜素生产的目的[2-5]。Yuan等为了鉴定MEP途经的限速步骤，利用同源重组的方法，用T5启动子在染色体上分别替换了MEP途径的各基因的启动子，发现调控dxs、idi、ispB、ispDF基因后，β-胡萝卜素产量分别提高了 100%、40%、20%和40%。用T5启动子对这4个基因进行组合调控后，β-胡萝卜素产量提高了6.3倍，达到6 mg/g干重细胞。Suh用强启动子T5调控MEP途经的关键基因dxs、idi和ispDF后，β-胡萝卜素产量比对照提高了4.5倍[8]。

然而强启动子对于获得目的产物的最大代谢流量来说并不一定是最优的[9]。Kim等在研究不同拷贝数质粒表达外源基因对番茄红素产量影响时发现，低拷贝质粒表达外源基因使重组大肠杆菌番茄红素产量更高[10]。因此，代谢途径中的基因应该有一个最适的表达强度，从而避免因有毒代谢中间物的积累而导致的生长受限和产量下降[9-11]。使用人工调控元件文库，特别是启动子文库，可以对代谢途径中的基因进行精确调控，从而获得代谢途径中基因的最适表达强度[11-14]。Alper等使用多个人工启动子对 dxs基因进行调控，鉴定出对于番茄红素生产的最适表达强度[11]。Meynial-Salles等使用 3个人工启动子对 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因 (gapA)进行调控，鉴定出对于甘油生产的最适表达强度[13]。

本研究中我们首先在大肠杆菌中引入 β-胡萝卜素合成基因 crtEBIY，创建出 β-胡萝卜素的合成途径。然后用前期构建的调控元件文库中的6个不同强度的调控元件[15]对MEP途径的7个基因 (图 1，dxs，dxr，ispDF，ispE，ispG，ispH和idi)和FPP合成酶基因 (ispA)进行调控，探索其对β-胡萝卜素产量的影响，为实现MEP途径各基因的最优表达提供理论基础和借鉴。

图1 大肠杆菌中用于萜类化合物合成的 MEP途径和引入的β-胡萝卜素合成途径Fig. 1 MEP pathway for isoprenoid biosynthesis in E. coli and heterologous β-carotene synthetic pathway.Abbreviation: G-3-P: glyceraldehyde-3-phosphate; DXP:1-deoxy-D-xylulose-50phosphate; MEP: 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate; CDP-ME: 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol; CDP-MEP: 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphate; MEC: 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate; HMBPP: 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate; IPP: Isopentenyl diphosphate; DMAPP: dimethylallyl diphosphate; GPP:geranyl diphosphate; FPP: farnesyl diphosphate; GGPP:geranylgeranyl diphosphate.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

氨苄青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素，购自上海生工生物工程有限公司；质粒小量快速提取试剂盒购自美国Axygen公司；DNA回收试剂盒购自美国Biomiga公司；PrimeSTAR HS DNA聚合酶，DNA Marker trans2K，购自大连宝生物工程公司；限制性内切酶PacⅠ、BamHⅠ、DpnⅠ、T4 DNA连接酶、快连酶、T4多聚核苷酸激酶购自NEB公司；胡萝卜素标品购自美国Sigma公司 (Cat. No. C4582)；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

PCR扩增仪，Eppendorf Mastercycler gradient；全自动凝胶成像系统，AlphaImager HP；电转仪，MicroPulser；台式高速离心机，Eppendorf 5415D；紫外可见分光光度计，Shimadzu UV-2550；高速冷冻离心机，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色谱，Agilent Technologies Series 1200。

1.1.3 菌株

本研究所用菌株已经在表1中列出。

表1 本研究所用的大肠杆菌菌株Table 1 Escherichia coli strains used in this work

续表1

1.2 方法

1.2.1 培养基及培养方法

每升LB培养基包括10 g胰蛋白酶蛋白胨，5 g酶酵母提取物和5 g氯化钠；氨苄青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素终浓度分别为 100、34、50 μg/mL。

好氧培养：将保存于−80 °C的菌种在加有相应抗生素的平板上活化，挑单菌落到4 mL LB试管中 (15 mm×100 mm)中，培养含 pTrc99AM-crt质粒的菌株的培养基加氨苄青霉素，培养含pACYC184-M-crt质粒的菌株的培养基加氯霉素，30 °C、250 r/min过夜培养，1%的接种量转接到好氧培养基 (相应的抗生素)中，30 °C、250 r/min培养。待生长2 h后，即OD600=0.1时，添加终浓度为1 mmol/L的诱导剂IPTG (异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷)进行诱导。在培养 22 h后，收集菌液用于β-胡萝卜素产量的测量。

1.2.2 β-胡萝卜素产量的检测方法

通过测定丙酮萃取的β-胡萝卜素在 453 nm下的吸收来确定β-胡萝卜素产量[2]。取2 mL培养的菌液于14 000 r/min离心3 min，无菌水清洗后，用1 mL丙酮悬浮沉淀，在55 °C黑暗条件下萃取15 min，然后将样品在14 000 r/min下离心10 min，将含有β-胡萝卜素的上清转入新的离心管中。紫外分光光度计453 nm下测定β-胡萝卜素吸收值，并计算其对细胞浊度 (OD600)的相对值，表示单位菌体β-胡萝卜素的相对产量。除此之外，用高效液相色谱测定β-胡萝卜素的绝对产量。检测条件：VWD检测器，Symmetry C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇：乙腈：二氯甲烷(21∶21∶8)，流速1.0 mL/min，柱温30 °C，检测波长450 nm。每个待测样品分别有3个平行样，实验结果取自3个平行的平均值。用购自Sigma公司的β-胡萝卜素标准品构建HPLC标准曲线。

1.2.3 表达外源胡萝卜素基因的质粒构建

构建用于表达外源胡萝卜素基因的质粒pTrc99A-M 和 pACYC184-M (图 2)。以质粒pTrc99A的DNA为模板，通过引物99A-F1-PacⅠ-SpeⅠ-NdeⅠ/99A-R1-PacⅠ扩增DNA片段1 (表2)，使得 PacⅠ、SpeⅠ和 NdeⅠ酶切位点位于pTrc99A质粒lacI基因的前面，PacⅠ酶切位点位于转录终止子rrnB的后边。将片段1用DpnⅠ进一步酶切，并用T4多聚核苷酸激酶磷酸化。以质粒 pTrc99A的 DNA为模板，通过引物99A-F2/99A-R2扩增DNA片段2 (表2)，DpnⅠ酶切，并在快连酶作用下与磷酸化的DNA片段1连接，转化大肠杆菌 trans10感受态细胞，在含有终浓度为50 μg/mL的氨苄青霉素LB培养基上过夜培养。挑选 5个克隆，提取质粒 DNA，并用 PacⅠ、BamHⅠ进行酶切验证。将正确的阳性克隆命名为pTrc99A-M。同样的方法，以质粒pACYC184的 DNA为模板，通过引物 184-F2/184-R2扩增DNA片段3 (表2)，DpnⅠ酶切，并在快连酶作用下与磷酸化的DNA片段1连接，并用PacⅠ和BamHⅠ进行酶切验证。将正确的阳性的克隆命名为pACYC184-M。

图2 携带β-胡萝卜素合成基因的质粒构建示意图Fig. 2 Construction of plasmids containing carotenogenic genes for β-carotene production.

成团泛菌Pantoea agglomerans中β-胡萝卜素合成基因 (crtEXYIB)是成簇存在的[16]。因此以成团泛菌CGMCC No. 1.2244的基因组DNA为模板，通过引物crt-cluster-f/crt-cluster-r扩增β-胡萝卜素合成基因操纵子 (crtEXYIB)(表2)，将纯化后的crtEXYIB片段及pTrc99A-M质粒经EcoRⅠ和 SalⅠ双酶切，在 T4 DNA连接酶的作用下16 ℃连接，得到质粒pTrc99A-M-crt。同样的方法，将该片段及pACYC184-M质粒用PacⅠ酶切，纯化回收，在 T4 DNA连接酶的作用下16 ℃连接，得到质粒pACYC184-M-crt(图 2)。

1.2.4 用不同的调控元件在大肠杆菌中对类异戊二烯基因的表达进行调控

用6个不同强度 (M1-12，M1-64，M1-30，M1-46，M1-37 and M1-93)的人工启动子调控元件对大肠杆菌MEP途径的7个基因 (包括dxs，dxr，ispDF，ispE，ispG，ispH，idi和 ispA)和ispA基因在染色体水平上进行调控。相对于大肠杆菌中诱导后 lacZ启动子，调控元件的强度M1-12、M1-64、M1-30、M1-46、M1-37和 M1-93分别是它的0.1、0.4、0.8、1.7、2.5和5倍[15]。按照Lu等描述的方法，通过一对通用引物，利用不同强度的调控原件调控每个基因的[15](图3)。上游引物 gene-up-FRT，包括调控基因原始调控区域外的50个碱基和与FRT序列同源的20个碱基。下游引物为gene-RBS-down，包括和大肠杆菌lacZ基因的核糖体结合位点同源的15个碱基和待调控基因起始密码子后的50个碱基 (图3，表2)。对于dxs基因，使用dxs-up-FRT/dxs-RBS-down引物 (表 2)，以信使 RNA稳定区文库 1(M-Lib1)中的相应重组菌株的基因组DNA扩增DNA片段[15]，将片段电转入含有pKD46的大肠杆菌MG1655感受态细胞中，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板中过夜培养，挑选单克隆，用引物dxs-up-FRT/dxs-381-down进行PCR验证(表2)。验证正确的克隆，将其命名为dxs-M1-12-FKF、dxs-M1-64-FKF、dxs-M1-30-FKF、dxs-M1-46-FKF、dxs-M1-37-FKF以及dxs-M1-93-FKF。采用同样的方法调控其他基因，所用引物序列在表2中列出。为了在同一重组大肠杆菌中同时调控MEP途径中的多个关键基因，根据Datsenko描述方法[17]去除 idi-M1-37-FKF中的 FRT-Km-FRT，得到idi-M1-37，然后按照上述一步调控方法用 M1-64和 M1-37启动子调控 idi-M1-37的dxs基因。将质粒pACYC184-M-crt 转入所有调控过的重组菌株中，用于检测β-胡萝卜素产量。

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this work

续表2

图3 用6种不同强度调控元件调控dxs基因表达的示意图Fig. 3 Modulation of dxs gene expression with six artificial regulatory parts.

2 结果与分析

2.1 表达载体的构建

为了有效表达外源基因，本研究通过 PCR的方法，重新构建了两个表达载体pTrc99A-M和pACYC184-M，这两个质粒具有相同的启动子和多克隆位点，具有不同的复制起始位点、抗性基因和不同的拷贝数，利用这两个质粒可以有效比较相同条件下，不同拷贝数的外源基因对目标产物的影响。按照图2所示构建质粒。

质粒构建成功后，限制性内切酶PacⅠ分别酶切两个质粒，验证是否为正确连接。结果如图4所示，pTrc99A-M经PacⅠ酶切后得到大小为 1 771 bp和 1 978 bp的条带(图 4A)。pACYC184-M 经限制性内切酶 PacⅠ酶切的大小为1 978 bp和2 204 bp的条带 (图4 B)。结果与预期一致，说明质粒构建成功。

图4 重组质粒pTrc99A-M和pACYC184-M的酶切鉴定Fig. 4 Identification of pTrc99A-M and pACYC184-M by restriction endonuclease digestion.(A)M: DNA marker trans2K; 1: pTrc99A-M; 2:pTrc99A-M digested with Pac I. (B)M: DNA marker trans2K; 1: pACYC184-M; 2: pACYC184-M digested with Pac I.

2.2 外源胡萝卜素基因表达质粒的构建

大肠杆菌本身没有合成β-胡萝卜素的能力，但是引入crtEBIY基因后，大肠杆菌就可以生产β-胡萝卜素[18]。按照图 2所示，克隆成团泛菌CGMCC No. 1.2244的β-胡萝卜素合成基因操纵子，构建 pTrc99A-M-crt和pACYC184-M-crt质粒，用于生产β-胡萝卜素。

重组质粒pTrc99A-M-crt构建成功后，经限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切验证，得到大小分别为5 804 bp和3 716 bp的条带 (图5A)，且测序正确；重组质粒pACYC184-M-crt经限制性内切酶PacⅠ酶切的大小为7 749 bp和2 204 bp的条带 (图5B)。结果与预期一致，并测序正确，说明质粒构建成功。

2.3 不同质粒对β-胡萝卜素产量的影响

图5 重组质粒pTrc99A-M-crt和pACYC184-M-crt的酶切鉴定Fig. 5 Identification of pTrc99A-M-crt and pACYC184-M-crt by restriction endonuclease digestion.(A)M: DNA marker trans2K; 1: pTrc99A-M-crt digested with EcoR I and Sal I; 2: pTrc99A-M-crt. (B)M: DNA marker trans2K; 1: pACYC184-M-crt digested with Pac I; 2: pACYC184-M-crt.

因为 pTrc99A-M-crt和 pACYC184-M-crt拷贝数不同，对于 β-胡萝卜素生产的影响必然不同。所以将这两个质粒转化大肠杆菌MG1655，以确定不同拷贝数对β-胡萝卜素产量的影响。

结果表明 (图6)，虽然 pTrc99A-M-crt的拷贝数比 pACYC184-M-crt高，但是当大肠杆菌MG1655中含有pACYC184-M-crt质粒时，产量是含pTrc99A-M-crt的大肠杆菌的1.69倍。说明并不是基因表达越高，产量就越高。Albermann等得到的类似研究结果，他们在研究番茄红素基因的不同表达水平对番茄红素产量的影响时，发现番茄红素基因低水平表达，更有利于番茄红素的产生[19]。

2.4 调控萜类合成途径基因的表达来提高 β-胡萝卜素产量

用 6个强度的人工调控元件，对大肠杆菌MG1655的MEP途径的7个基因和ispA基因调控，将得到的菌株转化 pACYC184-M-crt。1 mmol/L IPTG诱导基因表达后，测定β-胡萝卜素的产量。结果表明，不同调控元件对8个基因进行调控，β-胡萝卜素的产量发生了显著的变化(图 7)，每一个基因的最适调控强度也各不相同(图 7和表 3)。

图6 转化不同拷贝数质粒后β-胡萝卜素产量的比较Fig. 6 Comparison of β-carotene production by MG1655 transformed with pACYC184-M-crt and pTrc99A-M-crt.

dxs和idi被认为是类异戊二烯合成途径中2个主要的限速步骤，所以增加这两个酶的活性来提高类胡萝卜素的产量是一个通用的策略[17-20]。与之前的工作相符，我们发现调控dxs和idi基因比调控 dxr、ispDF、ispE、ispG和 ispH在提高 β-胡萝卜素产量方面更为有效。用 M1-37调控元件调控dxs基因，使得β-胡萝卜素的产量是野生菌的3.5倍，这也是所有调控过的菌株中效果最好的 (表3)。调控idi和ispA基因使得β-胡萝卜素的产量有了中等程度的提高，是野生菌的2.1和 2.3倍 (表 3)。调控 dxr、ispDF、ispE、ispG和 ispH 基因后，β-胡萝卜素的产量是野生菌的1.2到1.4倍。我们也用HPLC检测了β-胡萝卜素产量最高的菌株 (含有pACYC184-M-crt质粒的 dxs-M1-37-FKF菌株)。结果表明 β-胡萝卜素是单一的类胡萝卜素化合物，产量为7.8 mg/g干重细胞。

表3 调控萜类合成途径基因后β-胡萝卜素的相对产量Table 3 Relative β-carotene production of engineered E. coli after modulating isoprenoid gene expression

Yuan等[2]的研究表明，用高强度的T5启动子调控MEP途径的dxs、ispDF、ispE和idi这4个基因时，β-胡萝卜素产量分别提高了 100%、40%、20%和40%；但用高强度的T5启动子调控dxr、ispG和ispH基因时，β-胡萝卜素产量反而下降了。本研究使用了6个具有不同强度的人工调控元件对MEP途径的这7个基因进行调控，发现用适当强度的调控元件对dxr、ispG和ispH基因进行调控后，也能够提高β-胡萝卜素的产量(分别提高了40%、20%和20%)。另外，我们调控 dxs、ispDF、ispE和 idi这 4个基因，β-胡萝卜素产量提高的幅度比用T5的更大，分别提高了 250%、40%、40%和 110%。除此之外，我们还首次对ispA基因进行调控，发现其使β-胡萝卜素产量提高了130%，表明该酶可能也是萜类化合物合成途径的一个关键限速步骤。本研究的结果表明使用多个不同强度的调控元件对基因表达进行调控比仅使用强启动子调控更为有效。

图7 调控萜类合成途径基因后β-胡萝卜素的相对产量 (和野生型大肠杆菌MG1655相比较)Fig. 7 Relative β-carotene production after modulating isoprenoid gene expression, which was compared with the wild type E. coli MG1655. All strains were transformed with pACYC184-M-crt.

2.5 组合调控萜类合成途径关键基因的表达来提高β-胡萝卜素产量

通过利用不同调控元件调控MEP途径各基因，发现对dxs和idi基因调控后，β-胡萝卜素的产量提高最大，因此将idi基因调控效果最好的菌株idi-M1-37-FKF的FRT-km-FRT敲除，然后用M1-64和M1-37调控dxs基因，将得到菌株转化pACYC184-M-crt后测定β-胡萝卜素产量。对大肠杆菌MG1655进行dxs和idi组合调控后，β-胡萝卜素产量分别比野生菌提高了 5.5倍和 8倍 (图8和表3)。用HPLC测定β-胡萝卜素产量最高菌株idi-M1-37-dxs-M1-37-FKF (pACYC184-M-crt)，产量为17.59 mg/g干重细胞。

Yuan等用T5启动子对dxs、ispDF、ispB和idi这4个基因进行组合调控后，β-胡萝卜素产量提高了6.3倍，达到6 mg/g干重细胞[2]。Suh用强启动子T5调控MEP途经的关键基因dxs、idi、ispDF后，β-胡萝卜素产量比对照提高了4.5倍[8]。本研究使用多个不同强度的调控元件对dxs和 idi基因表达进行组合调控后，β-胡萝卜素产量提高了8倍，效果同样比仅使用强启动子调控更好。

图8 组合调控dxs和idi基因后β-胡萝卜素的相对产量 (和野生型大肠杆菌MG1655相比较)Fig. 8 Relative β-carotene production after combined modulation of dxs and idi gene expression, which was compared with the wild type E. coli MG1655. All strains were transformed with pACYC184-M-crt.

3 结论

本文将β-胡萝卜素合成途径导入大肠杆菌，并用多个调控元件对大肠杆菌MEP途径的7个基因和 ispA基因进行表达调控，发现 β-胡萝卜素产量提高的幅度比使用T5强启动子的效果要好。和以前报道不一样的是，我们发现用适当强度的调控元件对dxr、ispG和ispH基因进行调控后，也能够提高β-胡萝卜素的产量。另外，我们对dxs和idi基因进行组合调控后，将β-胡萝卜素产量提高了8倍，也比使用T5强启动子的效果要好。结果表明使用多个不同强度的调控元件对基因表达进行调控比仅使用强启动子调控更为有效，为使用基因表达调控优化目标产品合成途径的效率提供了一种新的方案。

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