液基细胞学联合HPV分型检测在妊娠合并宫颈上皮内瘤变患者的应用

郑寰宇 马 冬 李 鸥 李月红 张丽芬 刘桂艳 杨利华

近年来，宫颈癌在年轻妇女中的发生率逐年升高，妊娠合并宫颈癌是妊娠期最常见的恶性肿瘤，因此，在妊娠期间应加强对宫颈病变的筛查。本文应用液基细胞学联合HPV分型检测方法，探讨在妊娠合并宫颈上皮内瘤变患者应用的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本项研究以2006年1月至2012年1月于本院分娩的所有孕产妇为基础，全部选取具有完整“三阶梯诊断”的妊娠合并宫颈上皮内瘤变患者作为研究对象，符合选取条件的病例共72例。孕前1年内没有进行宫颈癌筛查的孕妇为筛查对象，对于宫颈细胞学（TCT）检测异常的患者补充进行HPV-DNA分型检测，结果显示ASC-US及HPV-DNA阴性者可不行阴道镜检，而此级别以上者均需进一步进行阴道镜检查，镜下考虑宫颈高等级病变及以上的患者再进行镜下活检，最终由病理科医师得出病理诊断。病理明确CIN诊断后，对患者进行保守观察处理，孕期进行3个月一次的TCT及阴道镜检查对病情进行观察，镜下考虑病变进展者重复活检，否则不需活检。

1.2 方法

1.2.1 检查方法 细胞病理学检查宫颈细胞涂片标本由妇科门诊医师采集，统一由病理科分析诊断。宫颈细胞学诊断依据TBS（The Bathesda System）诊断标准。

1.2.2 HPV基因型分型检测 对于宫颈细胞学（TCT）检测异常的患者补充进行HPV-DNA分型检测。凯普HPV分型一次检测6、11、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、CP8304等21种基因型，可判断多重感染。对选取的上述研究对象用凯普宫颈细胞收集保存系统采集保存宫颈细胞标本。采样前7天内不用阴道栓剂，前3d起禁止性生活。标本4℃冰箱保存，两周内检测。过程包括：1）样本DNA提取：用QIA Min试剂盒（德国，QIAGEN公司）抽提DNA；2）PCR扩增：将PCR反应试剂及DANTaq酶按比例混合后每反应管加入20 μL，再加入DNA模板5 μL，混合后进行PCR扩增，每一批次同时扩增HPV18阳性对照和阴性对照各1份；3）导流杂交：凯普医用核酸分子快速杂交仪及配套试剂盒由北京仕基辰源公司提供。在杂交平台上放入标记有寡核苷酸探针的低密度基因芯片，一次同时检测15个样本。按试剂盒说明进行导流杂交，酶标显色；4）结果判断：肉眼观察检测结果，阳性点呈现蓝紫色圆点，根据芯片上HPV分型分布相应的点判断HPV亚型，多点阳性即为多重感染。每一张芯片有PCR反应质控点和杂交显色质控点各一个。以上均由宫颈病变中心分析诊断。

1.3 统计学分析

本项研究采用相关临床病例，回顾性数据采集的方法进行分析研究。有关数据的统计处理采用SPSS 10.0软件进行。

2 结果

从2006年1月至2012年1月，妊娠合并宫颈上皮内瘤变者72例，发生率为0.16%。18例患者平均年龄为30.7±3.4岁，明确诊断的时间平均在孕76.7±24.9 d。72例患者均进行了完整的“三阶梯诊断”，病理诊断结果显示为CIN。72例妊娠合并宫颈上皮内瘤变患者中，全部患者进行了产前TCT检测，结果显示（表1）共有56例患者进行了产前HPV分型检测，56例标本中48例HPV检测结果为阳性（85.7%），CINⅠ组共16例：8例（50.0%）HPV为阳性，其中HPV16感染4例占25%；CINⅡ组12例：12例（100.0%）HPV阳性，8例（67.0%）为HPV16，感染；CINⅢ组28例，28例（100.0%）HPV检测为阳性，HPV16感染20例，占71.4%，结果显示（表2）。

表1 72例妊娠合并CIN患者产前TCT检测结果Table 1 TCT test results of 72 cases of pregnancy with cervical epithelial neoplasia

表2 56例妊娠合并CIN患者产前HPV分型检测结果Table 2 HPV test results of 56 cases of pregnancy with cervical epithelial neoplasia

3 讨论

目前，妊娠期妇女宫颈病变的筛查与非妊娠期妇女宫颈病变筛查方法相同，主要是细胞学检查［1］，ASCCP指南指出尽管细胞学筛查宫颈病变取得了成功，细胞学还是有一些局限性，这些局限性使得使用TCT联合HPV分型检测方法，具有相当的临床意义。Mark等［2］认为高危型HPV阳性强烈预示着CINⅡ/Ⅲ的存在或将来有可能发展为CINⅡ/Ⅲ的可能，并且发现细胞学由异常转为正常的患者，其高危型HPV也随之消失，这种细胞学的转变平均迟于高危型HPV转阴0.3年。另外，国外不同国家妇女HPV感染亚型也并不相同［3］。杜蓉等［4］认为 TCT联合 HPV 分型检测对ASC的分流监测具有重要临床价值。国内报道妊娠期宫颈细胞涂片结果异常的发生率在2%～7%［5］，妊娠期HPV感染率达11.6%～28.2%［6］，国外研究［7-8］应用PCR技术检测妊娠期妇女和非妊娠期妇女HPV的感染情况，其结果表明，妊娠并不增加HPV感染率，即妊娠期妇女与非妊娠期妇女面临HPV感染的风险是相同的，宫颈HPV感染是早产的一个危险因素，宫颈细胞学检验是一种筛查感染和炎症的妊娠期女性并预测妊娠结局的有效工具［9］。关于妊娠合并宫颈上皮内瘤变的发生率，国外有关报道显示妊娠合并宫颈上皮内瘤变的发生率高达1%［10］，本项研究显示为2.1%，与报道基本符合。在检查者中，宫颈出血率高于非妊娠期，局部压迫5～10 min后出血停止，无一例流产出现，因此可见，选择应用TCT联合HPV分型检查，可及早发现妊娠期宫颈病变，从而给予及时的诊断及治疗，减少孕期并发症的发生。本文提示妊娠期行TCT联合HPV分型检测，是安全有效的。有研究显示宫颈细胞学检查对于宫颈高度病变的敏感性在70%～80%［11］，但是由于妊娠这个基本因素的存在，宫颈外翻、蜕膜细胞或宫颈炎症均会干扰细胞学检查结果。对于孕期TCT结果异常者，建议同时进行HPV-DNA分型检测，本文其中12例（85.7%）为阳性结果，与报道基本符合。目前世界公认HPV高危型持续感染是宫颈癌发病的主要原因，明确HPV感染及型别有利于评价该患者的预后，是指导追踪和治疗的有效方式。国外一项配对研究显示，早中孕期高危型HPV的感染率，在妊娠妇女与非妊娠妇女中基本相同，但孕产妇在晚孕期和产后对高危型HPV的清除率比非妊娠妇女要高［12］，这种现象提示可能与妊娠免疫状态的改变有关。CIN的组织形态主要是细胞分化和结构的不典型性，即细胞排列极性消失，胞质无分化，无明显的细胞边缘，核质比增大。CINⅠ可自行消退或恢复正常。这可能由于CINⅠ细胞形态易与炎症性或不典型修复性细胞混淆，而并非肿瘤性病变。CINⅡ见于基底及中层细胞，CINⅢ则见于中层及表层细胞，妊娠合并CIN患者进行的产前HPV分型检测显示，HPV16在CIN中扮演重要角色。本项研究72例中，48例HPV检测阳性的患者均显示HPV高危型感染，其中与宫颈高等级病变相关性最大的HPV16型感染有32例。文献报道［13］和本研究均提示，HPV16型作为与宫颈癌关系最为密切的高危亚型，非常值得关注。本研究还提示，TCT联合HPV分型检测，检查宫颈CINⅡ/Ⅲ敏感度和阴性预测值明显提高，同时能把宫颈CIN漏诊率降到最低，因此是妊娠期宫颈病变最好的筛查方法。妊娠期妇女作为特殊人群，妇产科医师应利用产前检查的良好时机，应用TCT联合HPV分型检测方法，进行广泛的防癌普查，提前预测发病风险，及时诊断，减少对母儿的危害［14-15］，同时降低宫颈癌的发病率。

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12 张传英,王 敏.妊娠期宫颈上皮内瘤变的筛查和处理进展[J].实用妇产科杂志,2007,23(9):517-519.

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15 Tarka A,Szczepańska M,Rokita W,et al.Risk assessment of chronic HPV HR infection in babies who contacted the virus in the perinatal period[J].Ginekol Pol,2011,82(9):664-669.