微弧氧化钛表面对成骨细胞形态及细胞骨架的影响

乔磊???丁仲鹃???张立亚???牛涛

[摘要] 目的 研究微弧氧化钛表面对成骨细胞形态及细胞骨架的影响。方法 将直径15 mm、厚度1 mm的纯钛片根据表面处理方法不同分为4组：机械打磨（G）组、喷砂（SB）组、打磨微弧氧化（GMAO）组和喷砂微弧氧化（SBMAO）组。采用扫描电子显微镜（SEM）、激光共聚焦显微镜（LSCM）研究钛片表面成骨细胞生长情况及细胞骨架的改变。结果 成骨细胞接种12 h后，各组细胞均沿钛片表面铺展开，且GMAO组和SBMAO组细胞覆盖于火山口状微孔上。各组肌动蛋白纤维清晰可见，GMAO组和SBMAO组肌动蛋白纤维平行排列，汇聚成束伸向微孔内。结论 微弧氧化后的钛表面可以影响成骨细胞铺展的形态及细胞骨架的排列。

[关键词] 微弧氧化； 激光共聚焦显微镜； 成骨细胞； 细胞骨架

[中图分类号] R 783.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.006

种植体成功的关键在于形成良好的骨结合，而成骨细胞是骨结合的关键。种植体植入后，成骨细胞首先在种植体表面黏附、丛集，然后分泌骨基质，启动新骨生成。新骨从种植体表面逐渐向骨创面生长、延伸，最终形成种植体与骨组织的骨结合。由此可见，提高成骨细胞的成骨活性是提高种植成功率的有效途径。目前种植体表面改性的主要方法有表面形貌改性、表面化学成分改性及表面功能涂层改性。微弧氧化是目前研究中的热点。有研究[1-3]报道，微弧氧化表面对成骨细胞的黏附、增殖、分化均有促进作用。本实验在打磨和喷砂基础上，采用微弧氧化法处理钛片，研究微弧氧化钛表面对成骨细胞形态及细胞骨架（cytoskeleton，CSK）的影响。

1 材料和方法

1.1 钛片的表面处理和分组

将直径为15 mm、厚度为1 mm的钛片，按处理方法不同分为4组：机械打磨（G）组、喷砂（SB）组、打磨微弧氧化（GMAO）组和喷砂微弧氧化（SBMAO）组。

G组采用机械打磨方法，依次用防水砂纸240、360、600、800目同向打磨钛片，使表面光滑，呈金属光泽，肉眼观划痕一致。SB组在机械打磨的基础上，使用40～60目的二氧化钛砂在6.5 kPa、10 cm距离条件下均匀喷砂。GMAO组为将经过机械打磨的钛片用丙酮在超声波清洗机中清洗，干燥后进行微弧氧化。微弧氧化电解液的基本组成成分为20 g·L-1 Ca（CH3COO）2·H2O、9.3 g·L-1 Na5P3O10和Na2SiO3·9H2O，去离子水为溶剂，试剂均为分析纯。将钛片作为阳极，不锈钢电解槽为阴极进行微弧氧化。实验所用的电参数为：正向电压350 V，负向电压160 V，频率800 Hz，处理时间20 min，电解液通过冷却水循环系统进行冷却，微弧氧化过程中温度控制为15～

30 ℃。SBMAO组为将经过40～60目喷砂的钛片用丙酮在超声波清洗机中清洗，干燥后进行微弧氧化。

1.2 成骨细胞的体外培养

采用改进后的贴壁组织块分步消化法体外培养成骨细胞。

1.3 钛片表面成骨细胞的形态变化

取生长至第3代的成骨细胞，无菌PBS冲洗后0.25%胰酶消化，吹打均匀后调整细胞密度至每毫升4×104个，用加样器吸取500 ?L细胞悬液接种于放有预置清洁钛片的24孔板内，每组3枚钛片。当分别培养至2、4、12 h后弃去培养液，PBS冲洗，室温加入4%多聚甲醛固定10 min，乙醇梯度脱水（体积分数分别为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，前6种体积分数每种脱水2次，每次3 min，100%体积分数脱水3次，每次3 min），真空干燥，喷金，扫描电子显微镜（scanning electron micro-scope，SEM）观察成骨细胞形态并拍照。

1.4 钛片表面成骨细胞内CSK的变化

将接种好成骨细胞的各组钛片进行异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽（fluorescein isothiocyanate-phalloidin，FITC-phalloidin）室温染色60 min，PBS清洗细胞3次，置于激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）下观察CSK的微丝形态变化并拍照。

2 结果

2.1 钛片表面成骨细胞形态的变化

成骨细胞接种于钛片表面不同时间的细胞形态见图1。

成骨细胞接种2 h（图1第1行），与刚消化下来时的圆形细胞相比，各组细胞已经有明显的伸展，体积也有增大。G组细胞向四周伸展，无方向性，细胞边缘与钛表面结合紧密。SB组细胞有选择性地附于喷砂形成的孔洞内，细胞形态不规则，细胞足进一步伸展攀附于孔洞边缘，与钛片粗糙表面结合紧密。GMAO组细胞完全平铺于基底上，周围细胞足伸入火山状孔洞内。SBMAO组细胞完全铺展开，大部分细胞位于凹陷处，形态不规则，细胞覆盖于大量火山状孔洞上，细胞扁平，甚至可以见到整个细胞覆盖于孔洞之上，周边细胞足伸入孔洞内，与孔洞结合紧密。

成骨细胞接种于钛片表面4 h（图1第2行），各组细胞的体积进一步增大。G组细胞形状扁平，细胞长轴方向与表面划痕方向一致。SB组细胞体积已经大于表面孔洞，细胞跨越孔洞凹陷，周边细胞足明显伸入周围的细小孔洞内。SBMAO组细胞与SB组一样跨越孔洞凹陷，周边细胞足已经完全伸入上下联通的孔洞内。GMAO组细胞较SBMAO组更为扁平。

成骨细胞接种于钛片表面12 h（图1第3行），各组细胞铺展面积进一步增大。G组细胞沿着表面划痕方向完全铺展开。SB组细胞完全跨越表面孔洞凹陷，位于凹陷上方，周边细胞足伸长更加明显。GMAO和SBMAO组细胞之间有伪足相连，细胞有连接成片的趋势，周围可见伸入孔洞内的三维网络状结构。

2.2 钛表面对成骨细胞内CSK的影响

成骨细胞接种于钛片表面不同时间的细胞内CSK的微丝形态见图2。成骨细胞接种2 h（图2第1行），G 组肌动蛋白纤维成束状，有沿打磨形成的划痕方向铺展的趋势；SB组细胞陷于喷砂形成的孔洞中，肌动蛋白纤维束沿孔洞的边缘铺展，形态不规则；GMAO和SBMAO组肌动蛋白纤维沿小孔边缘伸展，微丝结构密集且不清晰，两组的差异不明显。

成骨细胞接种4 h（图2第2行），G组成骨细胞肌动蛋白纤维沿划痕方向生长，纤维伸长。SB组肌动蛋白纤维沿着表面形态排列，将细小的孔洞覆盖，有的伸入孔洞内。GMAO和SBMAO组表面的细胞均铺展开生长，将火山口状结构覆盖，火山口处肌动蛋白纤维沿火山口形成圈；GMAO组较SBMAO组细胞的形态更规则，类似于G组，而SBMAO组细胞形态更近似于SB组。

成骨细胞接种12 h（图2第3行），各组细胞体积均增大，肌动蛋白纤维均清晰可见，纤维束平行排列与细胞长轴一致。G组肌动蛋白纤维束沿划痕方向排列。SB组细胞向四周铺展，肌动蛋白纤维沿孔洞边缘排列，细胞覆盖在孔洞上方。GMAO和SBMAO组细胞肌动蛋白纤维平行排列，圈形排列的肌动蛋白纤维减少，肌动蛋白纤维在细胞边缘处汇聚成束，伸向孔洞内。

3 讨论

本实验采用LSCM观察不同钛片表面对成骨细胞CSK的影响。传统荧光显微镜是采用很宽的照明光束照射样品进行观察，因此存在样品在焦平面时的结构能清晰成像，但是在非焦平面的结构成像模糊的问题。LSCM采用点照明和点探测，利用照明针孔与探测针孔的共轭原理，可以得到连续的光切图像，呈现样品真实清晰的三维结构[2]。

本文所用抗体FITC-phalloidin能特异性地与聚合态的肌动蛋白结合。肌动蛋白是微丝的主要成分，参与维持细胞正常形态和结构，以及力学信号传导等多种功能，其结构重排及聚合和解聚的动态变化在一定程度上反映了细胞的功能状况。本研究中，成骨细胞接种于钛片表面2 h后各组细胞肌动蛋白纤维聚集，分布于表面隆起处；接种4 h后，2个微弧氧化组表面火山口处细胞肌动蛋白纤维均沿火山口形成圈，这可能与成骨细胞分泌的纤连蛋白多集中于表面粗糙孔洞的边缘处有关[3]。

整合素分子能特异性地与细胞外基质（extra-cellular matrix，ECM）中的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列结合，将细胞外的ECM分子与细胞内的骨架蛋白连接起来，形成ECM-整合素-CSK黏着斑，传导细胞内外的双向信号[4]。整合素与ECM结合后就与CSK发生联系，并发生簇集，从而介导细胞的黏附和迁移。材料表面经处理后，其粗糙度增加，细胞与材料的接触面积增大，这样在植入体内后，ECM会在材料表面形成一层生物大分子层，与细胞表面的整合素结合[5]。本实验中，经过微弧氧化处理的钛片表面的粗糙度明显高于G组及SB组。当成骨细胞黏附于材料表面后，开始铺展并伴随着伪足形成。ECM-整合素-CSK黏着斑在信号传导过程中重组肌动蛋白骨架，细胞变平并铺展[6]。本实验结果显示，12 h后各组细胞均已完全铺展，细胞肌动蛋白纤维排列成束且有规律，GMAO与SBMAO组均可见细胞之间的肌动蛋白纤维束相互连接，这与SEM观察到的细胞有连接成片的趋势相一致，提示SBMAO组与GMAO组钛片表面均有利于成骨细胞的ECM与整合素结合，从而介导细胞的黏附和迁移。本实验发现，随着培养时间的延长，各组细胞之间的肌动蛋白纤维铺展的差异逐渐减小，到培养12 h时，肌动蛋白纤维的铺展无明显差异，只是2个微弧氧化组细胞有连接成片的趋势。

[参考文献]

[1] 陈国平， 周征， 郑翼， 等. 成骨样细胞受力后细胞骨架中微丝形态结构变化的初步研究[J]. 华西口腔医学杂志， 2002， 20（3）：213-215.

Chen Guoping， Zhou Zheng， Zheng Yi， et al. The effects of the mechanical stress on the cytoskeleton filament Fac-

tion of osteoblast-like cells in vitro[J]. West China J Stoma-tol， 2002， 20（3）：213-215.

[2] Reuner KH， Wiederhold M， Schlegel K， et al. Autoregula-tion of actin synthesis by physiological alterations of the G-actin level in hepatocytes[J]. Eur J Clin Chem Clin Bio-chem， 1995， 33（9）：569-574.

[3] Postiglione L， Di Domenico G， Ramaglia L， et al. Different titanium surfaces modulate the bone phenotype of SaOS-2 osteoblast-like cells[J]. Eur J Histochem， 2004， 48（3）：213-

222.

[4] Liu S， Calderwood DA， Ginsberg MH. Integrin cytoplasmic domain-binding proteins[J]. J Cell Sci， 2000， 113（20）：3563-

3571.

[5] Hallab NJ， Bundy KJ， OConnor K， et al. Evaluation of metallic and polymeric biomaterial surface energy and sur-face roughness characteristics for directed cell adhesion[J]. Tissue Eng， 2001， 7（1）：55-71.

[6] Meyer U， Szulczewski DH， Moller K， et al. Attachment kinetics and differentiation of osteoblasts on different bio-material[J]. Cells and Materials， 1993， 2（3）：129-140.

（本文编辑 吴爱华）