参附注射液联合细胞因子对急性髓性白血病HL-60细胞来源的树突状细胞诱导生成及功能的影响

任莉莉 问明 李淑青 宋子正 商琰红 王素云 魏影非

白血病是一类起源于骨髓多能干细胞的恶性克隆性疾病，其发生和发展的主要原因是白血病细胞不能有效的激活T细胞而逃脱宿主免疫系统监视和清除。树突状细胞(DCs)是能激活初始型T细胞(native T cells)的专职抗原递呈细胞(APC)［1］，在激发抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)引起的过继性免疫治疗肿瘤中具有重要地位，成为肿瘤免疫治疗研究的热点。但体内DCs的含量很少，难以满足临床应用的需要。研究表明，DCs可在体外诱导、扩增，并可体外有效激活、诱导特异性抗肿瘤免疫。但DCs体外培养需要大量细胞因子，有研究也通过体外试验证实，应用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)，仅可使部分慢性髓性白血病(CML)原代细胞分化为DCs，且表面免疫分子表达低于正常细胞来源的 DCs，特别是 CD80、HLA-DR［2］。并且从急性髓细胞白血病(AML)细胞诱导培养DCs比CML细胞困难，以往的试验相对集中在CML来源，AML来源研究的较少，因此，有必要进一步探索提高体外诱导AML来源DCs质量的方法。

1 材料与方法

1．1 主要试剂 重组人GM-CSF由华北制药金坦公司惠赠;重组人IL-4为美国Pepprotech公司产品，比活性13 U/ng;异硫氰酸荧光素(FITC)-CD1a单抗、FITC-CD80单抗、藻红朊荧光素(PE)-CD83单抗、PE-HLA-DR单抗为美国B-D公司产品;IFN-γ试剂盒为深圳晶美生物工程公司。噻唑兰(MTT)购于Ameresco公司。药品:参附注射液由雅安三九药业有限公司提供;批号:050802。人急性髓性白血病细胞系HL-60细胞株由中国协和医科大学天津血液病研究所惠赠。

1．2 仪器 洁净工作台(苏州净化设备厂)，恒温CO2细胞培养箱(美国SHELDON公司)，低速离心机(日本KUBOTA)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，流式细胞仪(Vantage美国B-D公司)，酶标仪(北京Bintag公司)。

1．3 方法 DCs的培养和测定参照 Choudhury等［1，2］的方法，并加以改良。

1．3．1 体外诱导HL-60DCs:取HL-60细胞(调节细胞浓度为5×105/ml)，选用 IL-4+GM-CSF(终浓度分别为 50 ng/ml、100 ng/ml)、不 同 浓 度 的 SFI(9．38 mg/ml、18．75 mg/ml、37．5 mg/ml、75 mg/ml、150 mg/ml，均为生药浓度)及 IL-4+GM-CSF联合不同浓度的SFI(浓度分别同上)三种不同组合于37℃，5%CO2条件下诱导培养HL-60细胞，在倒置显微镜下观察细胞生长的动态变化。

1．3．2 DCs的流式细胞术分析:收集培养8～12 d的细胞，800 r/min离心10 min，取上清－20℃冻存留测细胞因子，细胞用PBS洗2次，以PBS悬浮细胞，调整细胞数为1×106/ml，分别加入抗FITC-CD1a、抗FITC-CD80、抗PE-CD83和抗PE-HLADR单克隆抗体，置暗处室温下反应15 min，上机检测。

1．3．3 DCs刺激同种混和淋巴细胞反应(allo-MLR):取培养的DCs，800 r/min离心10 min，用 PBS洗2次，加入丝裂霉素 C 25 μg/ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中孵育 30 min，PBS洗3次作为刺激细胞。分离健康人外周血单个核细胞(PBMNC)，以完全培养基37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中孵育2 h，轻轻吸出悬浮细胞，作为同种异体淋巴细胞即效应细胞。将刺激和效应细胞分别用RPMI-1640完全培养基悬浮，调节细胞浓度为1×105/ml，分别以 1×103/孔、3×104/孔和1×104/孔刺激细胞加入96孔平底培养板，每组设3个复孔，再加入效应细胞1 ×105/孔。即 DC∶淋巴细胞比例为1∶100，1∶30，1∶10。同时设空白对照孔，即只加入1×105/孔效应细胞，设3个复孔。补充培养基至总体积200 μl。在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养72 h后，每孔加入 MTT(5 mg/ml，每孔20 μl)继续培养4 h后终止培养，1 500 r/min离心5 min，弃去孔内培养液。每孔中加入二甲基亚砜(DMSO)100 μl，振荡混匀，560 nm检测OD值，3孔OD值取均值命名为A。刺激指数(SI)=实验孔A值/空白对照孔A值。

1．3．4 IFN-γ的测定:取上述冻存的上清，采用双抗体夹心ELISA法测定IFN-γ的含量，具体方法参照深圳晶美生物工程公司的ELISA检测试剂盒说明书。

1．4 统计学分析 应用SPSS 13．0统计软件，多组均数间比较采用多因素方差分析;两两比较采用LSD和SNK-q法检验;采用析因设计的方差分析检验SFI与(GM-CSF+IL-4)联合使用时的协同作用;采用直线相关分析 T细胞增殖反应与 DCs数量的相关关系，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 形态观察 处理前HL-60细胞呈球形，悬浮生长，表面光滑。仅加入GM-CSF及IL-4培养2 d后，2组部分细胞体积增大、增殖并开始表现多形性，培养8～12 d左右时可见较多具有典型树突状突起的细胞。而单独应用不同浓度SFI培养的HL-60细胞可见:150 mg/ml、75 mg/ml SFI处理孔细胞全部破碎死亡，37．5 mg/ml细胞增殖缓慢，18．75 mg/ml、9．38 mg/ml处理孔中细胞体积增大并增殖明显，但培养至8～12 d均未见具有树突状突起的细胞。GM-CSF+IL-4联合不同浓度 SFI诱导培养的HL-60细胞呈现不同的变化:150 mg/ml SFI组中细胞全部破碎死亡、75 mg/ml SFI组体积稍增大，但增殖缓慢，且树突状突 起 的 细 胞 少 见;但 在 37．5 mg/ml、18．75 mg/ml、9．38 mg/ml SFI处理孔中细胞体积增大并增殖，培养8～12 d左右时典型树突状细胞比例明显增加(图1)，尤以18．75 mg/ml SFI组 DCs形态的细胞比例最高，并可见细胞集落。

2．2 细胞表型变化 培养前 HL-60细胞 DCs表型 CD1a、CD80、CD83、HLA-DR表达很低。而单独以 SFI诱导培养的HL-60细胞上述DCs表型表达仍不高。以GM-CSF+IL-4诱导8～12 d后，细胞表型表达率均高于培养前和单独以SFI培养组，差异有统计学意义(P ＜0．05，HL-60DCs的 CD80除外)。以GM-CSF+IL-4和不同浓度SFI诱导培养后，HL-60细胞以18．75 mg/ml SFI+GM-CSF+IL-4培养的DCs标志表达最高，并显著高于其他各组(P＜0．05)，且有很好的协同作用(P＜0．05)。GM-CSF+IL-4与其他浓度SFI联用DCs表型表达率虽高于单用GM-CSF+IL-4培养组，但差异无统计学意义(P＞0．05)。见表 1。

2．3 DCs刺激同种异体T细胞增殖的能力 培养前HL-60细胞以及18．75 mg/ml SFI培养组仅有较弱的刺激T淋巴细胞增殖能力，且随着效靶比增加，刺激能力没有相应提高。在HL-60细胞中以GM-CSF+IL-4或SFI与GM-CSF+IL-4联用培养的DCs，刺激T淋巴细胞增殖的能力显著高于上述各组细胞。当效靶比为1∶100，1∶30，1∶10 时，刺激指数分别为 1．606 ±0．074 vs．2．280 ±0．097 vs．2．415 ±0．090 和 2．106 ±0．174 vs．2．728 ±0．125 vs．3．196 ±0．137(r=0．949，P ＜0．01)。并且SFI与GM-CSF+IL-4联用组显著高于GM-CSF+IL-4组(P＜0．05)。见表 2。

2．4 INF-γ的分泌水平 HL-60细胞不同组合条件下培养的上清中均有不同程度INF-γ的分泌，其中18．75 mg/ml SFI组INF-γ 含量低于 GM-CSF+IL-4组(P ＜0．01)。GM-CSF+IL-4联合SFI组中GM-CSF+IL-4联合18．75 mg/ml SFI组培养的HL-60细胞上清中INF-γ含量显著高于GM-CSF+IL-4联合其他浓度SFI培养的细胞(P＜0．01)，且有很好的协同作用(P＜0．05)。其他浓度SFI组含量不同程度的高于GM-CSF+IL-4组，但差异无统计学意义(P＞0．05)。见表3。

3 讨论

急性白血病属中医急劳、虚痨、血证、癥积的范畴，本虚标实、虚实错杂是本病的主要病机特征，治宜扶正祛邪，使毒祛瘀化，则正气得复。目前随着化疗方案的改进，AML的完全缓解率不断增加，然而无病生存的患者仍然有限，影响患者生存的主要原因就是微小残留病灶导致的复发，即便造血干细胞移植仍存在复发的风险。

表1参附注射液对培养的HL-60DCs的细胞免疫表达的影响n=3，%，±s

表1参附注射液对培养的HL-60DCs的细胞免疫表达的影响n=3，%，±s

注:与诱导前组比较，*P ＜0．05，#P ＜0．01;与对照组比较，△P ＜0．05，☆P ＜0．01;与 SFI组比较，□P ＜0．05，○P ＜0．01;与 GM-CSF+IL-4 组比较，▲P ＜0．05，★P＜0．01;与 GM-CSF+IL-4+SFI(37．5)组比较，■P ＜0．01;与 GM-CSF+IL-4+SFI(18．75 组)比较，●P ＜0．01

CD83 CD1a HLA-DR CD80诱导前组组别 SFI(mg/ml)表达情况0．74 ±0．57 1．07 ±0．71 0．52 ±0．51 0．51 ±0．41对照组 0 0．87 ± 0．42 1．46 ±0．76 0．77 ±0．31 0．72 ±0．20 SFI组 18．75 1．80 ±0．84 2．08 ±0．76 1．26 ±0．95 2．94 ±2．20 GM-CSF+IL-4 组 0 8．33 ±1．76#☆○ 11．86 ±3．86＊△□ 0．77 ±0．31＊△□ 0．77 ±0．31 GM-CSF+IL-4+SFI组 37．5 11．93 ±3．19#☆○ 14．90 ±6．89#☆○★ 14．06 ±4．84#☆○▲ 11．38 ±4．79#☆○★18．75 18．75 ±6．18#☆○★■ 24．32 ±7．44#☆○★■ 26．99 ±7．42#☆○★■ 18．24 ±3．13#☆○★■9．38 9．33 ±1．05#☆○● 13．74 ±3．79#☆○● 15．03 ±3．89#☆○▲■ 10．02 ±3．67#☆○★●0

表2 参附注射液对培养的HL-60DCs刺激T细胞增殖反应的影响

表3 参附注射液对培养的HL-60DCs培养上清液中INF-γ含量的影响n=3，±s

表3 参附注射液对培养的HL-60DCs培养上清液中INF-γ含量的影响n=3，±s

注:与诱导前组和对照组比较，*P ＜0．05，#P ＜0．01;与SFI组比较，△P ＜0．01;与 GM-CSF+IL-4 比较，☆P ＜ 0．05，□P ＜ 0．01;与 GM-CSF+IL-4+SFI(37．5)组比较，○P ＜0．05;与 GM-CSF+IL-4+SFI(18．75)组比较，▲P ＜0．01

HL-60 cells/HL-60-DCs诱导前组组别 SFI(mg/ml) IFN-γ浓度(pg/ml)15．52 ±4．03对照组 0 15．75 ±5．07 SFI组 18．75 22．89 ±7．58 GM-CSF+IL-4 组 0 37．35 ±8．31*GM-CSF+IL-4+SFI组 37．5 56．67 ±10．38#△☆18．75 73．34 ±14．40#△□○9．38 45．65 ±9．34#△▲0

图1 HL-60-DCs(Wright×1 000)

DCs起源于髓系，是迄今所知人体内最强大的抗原递呈细胞，能诱导原发和继发的免疫应答，激活辅助T细胞和细胞毒性T细胞，从而产生强大的抗肿瘤效应，因此DCs用于免疫治疗AML具有十分广阔的前景。目前虽然用体外培养的方法可将白血病细胞诱导分化成为DCs，但只能使一部分白血病细胞分化为DCs，且多数白血病细胞来源的DCs表面分子的荧光强度低于正常来源的DCs，特别是CD80、HLA-DR，而二者是APC细胞与T细胞相互作用中最重要的信号分子，故它们的表达率和表达量常会影响T细胞的激活和功能［3］。因而如何提高DCs的产量及成熟度，激活其功能，更有效而特异的杀死白血病细胞是白血病免疫治疗的研究热点。

来源于《济生方》或《济生续方》中参附汤的 SFI及其组分——人参、附子均具有调节改善机体免疫的功能，可诱导造血基质细胞表达 GM-CSFmRNA，促进 TNF-α、IL-1、IL-2等细胞因子的产生，配合化疗可改善白血病患者正气不足之状［4－6］，提示SFI可能参与调节DCs抗原提呈功能，因此本试验通过检测代表DCs成熟及功能的几个指标来研究SFI是否参与调节DCs的功能。

本实验发现在GM-CSF/IL-4联合适当浓度(18．75 mg/ml、37．5 mg/ml)SFI的作用下，白血病细胞可以诱导分化为DCs，能明显增强白血病-DCs表型(CD1a、CD80、CD83、HLA-DR)的表达率，另外还发现SFI对于白血病细胞存在双向调节作用。SFI在低浓度18．75 mg/ml和9．38 mg/ml时可促进HL-60DCs细胞的增殖。而在150 mg/ml和75 mg/ml浓度时，可导致HL-60细胞全部破碎死亡或增殖缓慢，而这种双向调节作用究竟是何种机制在发挥作用，还有待进一步的研究证实。

我们前期的试验证实与本试验结果相似。虽然单独应用SFI不能诱导DCs的生成，但GM-CSF+IL-4联合适当浓度的SFI能更有效地诱导DCs的生成和成熟。不同浓度的SFI对不同来源DCs诱导生成作用不同:诱导CML患者的PBMNCs和K-562细胞，SFI的最佳诱导浓度为75 mg/ml，对HL-60细胞则为18．75 mg/ml，且在相应的浓度下与GM-CSF及IL-4联合使用时有很好的协同作用，SFI对不同来源的细胞，有不同的最适浓度，可能与不同细胞对SFI敏感性不同有关，增殖速度快的细胞对SFI更敏感。

综上所述，SFI可以联合GM-CSF和IL-4诱导HL-60细胞成为成熟的DCs，使其抗原递呈功能明显增强，分泌INF-γ，并表现双向调节作用。当然，还有很多问题需要我们进一步探索，如，SFI毕竟为中药的混合制剂，其中的主要药物成分人参皂甙和乌头碱在调节免疫中究竟起协同还是拮抗作用，还是某一种成分的单独作用;乌头碱的心脏、神经毒性众所周知，怎样通过合理的比例使之更适合发挥免疫调节作用并避免不良反应;SFI在体内有无诱导DCs生成及促进DCs增殖和递呈抗原的功能等。相信随着研究的深入，必将会揭示SFI抗肿瘤机制的实质，为SFI配合治疗白血病提供可靠的依据。

1 刘开扬，张洪泉．中西医结合抗肿瘤的免疫学机制研究进展．时珍国医国药，2008，19:2049-2050．

2 王俊祥，王金铠，郑师陵，等．人慢性髓性白血病细胞系来源的树突状细胞免疫功能的体外研究．南京医科大学学报(自然科学版)，2003，26:579-590．

3 Fan P，Wu ZH，Wang S．An Investigation on the phenotype of cultured dendritic cells from the peripheral blood of patients with breast cancer．Journal Of Nanjing Medical University Ann Hematol，2002，16:115-120．

4 Oehler L，Berer A，Kollar M，et al．Culture requierments for induction of dendritic cell differentiation in acute myeloid leukemia．Ann Hematol，2000，79:355-362．

5 陈玉春．人参、附子与参附汤的免疫调节作用机理研究．中成药，1994，16:30-31．

6 王勇，王莎莉，王亚平，等．人参皂甙对人骨髓造血因子活性及其mRNA 表达的影响．解剖学报，1999，30:362-366．