健脾活血补肾汤对CIA大鼠血清IL-17及OPG/RANKL表达的影响*

喻建平 徐卫东，2△ 张艳珍 陈国忠 薛燕风

1江西中医学院附属医院，南昌 330006

2中国中医科学院临床基础医学研究所，北京 100070

·实验研究·

健脾活血补肾汤对CIA大鼠血清IL-17及OPG/RANKL表达的影响*

喻建平1徐卫东1，2△张艳珍1陈国忠1薛燕风1

1江西中医学院附属医院，南昌 330006

2中国中医科学院临床基础医学研究所，北京 100070

目的通过观察健脾活血补肾汤对关节炎(collagen induced arthritis，CIA)模型大鼠血清中炎性细胞因子白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、骨保护蛋白(osteoprotegerin，OPG)及核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)表达水平的影响，探索健脾活血补肾汤保护强直性脊柱炎关节骨质破坏潜在的分子药理机制。方法利用弗氏完全佐剂和牛Ⅱ型胶原建立大鼠关节炎(CIA)模型，自造模成功后第3天起分别按健脾活血补肾汤高、中、低剂量给药组及生理盐水给予大鼠灌胃处理，每天1次，连续灌胃30 d，处死大鼠，心脏采血取血清，用ELISA夹心法检测大鼠血清中IL-17、OPG及RANKL表达水平。结果健脾活血补肾汤高、中、低各剂量组CIA大鼠血清IL-17及RANKL水平均较模型组明显降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)；而OPG水平较模型组显著升高，差异有统计学意义(Plt;0.05)。结论健脾活血补肾汤可能通过降低CIA模型大鼠血清中IL-17及RANKL表达水平，升高OPG表达水平，而起到延缓关节炎性损伤所致的骨质破坏的作用。

CIA模型大鼠； 健脾活血补肾汤； 白细胞介素-17； 骨保护蛋白； 核因子κB受体活化因子配体

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是脊柱关节病的一种亚型，主要累及骶髂关节和中轴骨骼，好发于青少年，通常在18～22岁发病，男女比例约为2∶1。其特征是持续性炎症高度活动和低度活动相交替，以致关节软骨和骨被侵蚀和破坏，随后骨质硬化，最终静止于全脊柱的融合而失去劳动和自主生活能力[1-3]。骶髂关节边缘的骨质侵蚀是强直性脊柱炎早期的放射学特点之一，随病程的进展也会出现不同程度的关节畸形及骨质侵蚀。一般认为，一旦骨质遭到破坏，则意味着其病理改变进入不可逆期，因此延缓甚至阻断AS患者的骨质侵蚀成为AS治疗的重要靶标之一。现有研究[4-6]表明，白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)及成骨、破骨细胞的不平衡对 AS 病情进展起到决定性的作用，并且骨保护蛋白(osteoprotegerin，OPG)系统尤其是 OPG/核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)引发的保护性反应与成骨、破骨细胞不平衡的关系密切。目前，本病主要治疗药物如非甾体抗炎药、慢作用抗风湿药和糖皮质激素及生物制剂等，虽有一定临床疗效，但在保护骨质破坏方面的疗效尚不十分肯定[7]。健脾活血补肾汤是本科用于治疗强直性脊柱炎的经验方，由穿山龙、鸡血藤、徐长卿等中药组成，其主要功效为祛风除湿、益气健脾、活血通络和补益肝肾。经过长期临床观察证实，健脾活血补肾汤能够在较短的时间内缓解疼痛，控制病情，经过较长时间的治疗后，还具有一定的保护强直性脊柱炎骨质破坏的功效，且长期应用毒副作用也较轻微，但其具体分子作用机制还不清楚[8]。Ⅱ型胶原诱导的关节炎(collagen induced arthritis,CIA)模型鼠膝关节局部IL-17高表达可破坏OPG/RANKL平衡，促进骨侵蚀，加重关节破坏，OPG全身治疗可阻止这种关节破坏[9]。CIA模型鼠早期应用抗体中和内源性IL-17后，滑膜细胞RANKL的 mRNA水平显著降低，骨侵蚀破坏明显抑制[10]。因此，本实验观察了健脾活血补肾汤对CIA大鼠血清IL-17及OPG/RANKL的影响，以探索其保护关节炎性损伤所致的骨质破坏潜在的分子药理机制,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

Wistar大鼠60 只，清洁级动物，雌雄各半，4～6周龄，体重为(160±15) g，购于江西中医学院实验动物科技中心，许可证号为SCXK(赣)2003-0003。减毒卡介苗(长春生物制品研究所产品)；羊毛脂(中国嘉定华亭羊毛脂厂产品)；牛Ⅱ型胶原(typeⅡcollagen，CⅡ，美国Sigma 公司产品)。检测大鼠血清中OPG、RANKL及IL-17 ELISA 试剂盒(购自北京义翘神州生物技术有限公司)。

健脾活血补肾汤主要由穿山龙30 g，鸡血藤30 g，徐长卿15 g，鬼箭羽15 g等药组成，由江西中医学院附属医院药剂科制剂室制成为棕褐色药液(批号：2008102912875)，每100 ml含中药生药360 g。根据临床用药剂量及新药研究中动物用药剂量要求，采用高剂量标准，即相当于临床剂量的20倍，计算出大鼠用药剂量为9.6 g/kg。

1.2 实验仪器

超净工作台(苏州净化设备厂)、高速低温离心机(Eppendorf公司)、S648型电热恒温水浴箱(德国)、低温冰箱(4 ℃～-20 ℃，韩国LG公司)。

1.3 动物造模与分组

大鼠入实验室后适应性饲养1周，用随机数字表对样本进行随机化处理，并分为对照组、模型组、低剂量给药组、中剂量给药组、高剂量给药组共5组，每组雌雄大鼠各半。饲养于无毒塑料鼠笼内，每笼3～4只。自由饮水进食，喂养全价饲料，自然光照，室内温度保持在(22±1) ℃，相对湿度维持在40％～60％。

造模方法如下：将液体石蜡和羊毛脂(2∶1)于70 ℃水浴中充分混匀，高压灭菌(121 ℃、30 min)制成弗氏不完全佐剂，4 ℃保存。使用时将减毒卡介苗80 ℃ 灭活，与弗氏不完全佐剂混匀，制成弗氏完全佐剂，卡介苗的终浓度为10 mg/ml。将牛CⅡ溶于0.05 mol/L乙酸，并与等体积弗氏完全佐剂混合制成混悬乳剂，CⅡ终浓度为2 mg/ml。造模大鼠每只尾根部皮内注射200 μl上述乳剂，1周后，每只大鼠接受加强免疫，尾根部皮内注射乳化CⅡ100 μl，诱发CIA。对照组大鼠以相同剂量相同部位注射生理盐水。自造模成功后第3天起分别按健脾活血补肾汤高、中、低剂量给药组及生理盐水给予大鼠灌胃处理，每天1次，连续灌胃30 d。

1.4 关节炎症指数评定

采用关节分数评分法记录多发性关节炎病变的发生及严重程度，关节炎症的严重程度按照以下评分标准进行，分数越高，病情越重。每个肢体最高分为4分，每只大鼠最高分为16分，记分标准分5级(0～4)，具体标准如下：0分为无关节炎；1 分为关节轻度肿胀；2分为关节部位中度肿胀；3分为严重肿胀；4 分为严重肿胀且不能负重。

1.5 各组大鼠血清IL-17、OPG及RANKL水平的检测

各组大鼠分别心脏采血，离心取上清，-20 ℃ 保存备用。检测血清IL-17、OPG及RANKL 水平，具体操作严格按ELISA 试剂盒说明进行。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 一般观察

正常对照组大鼠后腿，可观察到其表面显现正常的粉红色，脚踝无肿胀，足趾不增厚。在免疫8～12 d 后，模型组大鼠开始出现症状，发病大鼠后腿可见脚踝明显肿胀，足趾明显增厚，整个后脚呈现红色或粉红色斑点，严重者可见紫色，且行走不便，不能负重。红肿逐渐消退出现关节强直、畸形以至功能障碍，表明慢性、对称性、多发性关节炎发生。48只免疫大鼠组中，有32 只发病明显；而对照组无发病大鼠。发病大鼠活动量明显减少，食欲下降，体重低于正常对照组。

2.2 CIA大鼠关节炎症指数评定

造模成功的CIA大鼠关节炎症指数与正常对照组比较，差异有统计学意义(Plt;0.05)。关节炎症指数随时间延长逐渐增高，免疫3周及4周后较免疫10 d后关节炎症更明显，差异具有统计学意义(Plt;0.05)。见表1。

2.3 CIA大鼠血清IL-17、OPG及RANKL 水平与炎症指数的相关性分析

免疫4 周后，造模成功CIA大鼠血清IL-17、RANKL 水平与其炎症指数呈正相关关系(r=0.569，r=0.482，均Plt;0.05)。与之相反，CIA 大鼠血清OPG 水平与炎症指数呈负相关关系(r=-0.491，Plt;0.05)。

表1 大鼠关节炎症指数的比较

与对照组相比*Plt;0.05

2.4 健脾活血补肾汤对CIA大鼠血清IL-17、OPG及RANKL水平的影响

采用双抗体夹心ELISA法检测大鼠血清中IL-17、OPG 和 RANKL水平。结果表明，模型组大鼠血清IL-17和RANKL水平均较对照组明显增高，二者相比差异有统计学意义(Plt;0.05)。由此可见，牛Ⅱ型胶原导致大鼠关节软骨损伤时，也刺激机体产生了大量的细胞因子，但其具体因果关系还需进一步的研究。而健脾活血补肾汤高、中、低剂量组大鼠血清IL-17及RANKL水平均较模型组明显降低(Plt;0.05)；而OPG水平均较模型组显著升高，差异有统计学意义(Plt;0.05)，但OPG/RANKL与模型组比较，差异无统计学意义(Pgt;0.05)。见表2-3。

表2 各组大鼠血清IL-17水平的比较

与对照组相比*Plt;0.05，与模型组相比△Plt;0.05

表3 各组大鼠血清OPG及RANKL的水平比较

与对照组相比*Plt;0.05，与模型组相比△Plt;0.05

3 讨论

IL-17是一种强大的前炎症细胞因子，也是炎症反应的微调因子，可上调软骨细胞及滑膜成纤维细胞基质金属蛋白酶的表达，增强软骨细胞及滑膜成纤维细胞基质金属蛋白酶(MMP-1，3，13 )表达，促进软骨蛋白多糖及胶原降解[11]，抑制软骨细胞蛋白多糖的合成[12]，并可增强单核细胞对软骨基质的破坏。同时其亦可诱导RANKL表达，破坏OPG/RANKL平衡，诱导破骨细胞祖细胞向成熟破骨细胞分化，增强了关节胶原破坏和重建，骨质破坏以及软骨破坏，并可能在将急性滑膜炎转变为慢性破坏性关节炎中起关键作用[13-16]。RANKL、NF-κB受体活化因子RANK及OPG系统是新近发现的一组调控破骨细胞分化的细胞因子，大量研究[17-19，9]表明RANKL/RANK/OPG系统在AS的骨质侵蚀中扮演重要角色，可能是治疗的靶点之一，OPG具有广泛的组织分布，在骨骼中的OPG主要由成骨细胞谱系的各种细胞产生，它是一种诱饵受体，其作用是结合或中和可溶性RANKL及与成骨细胞/基质细胞结合的RANKL，或中和其他TNF配基家族成员，从而阻断RANKL与RANK的结合，抑制破骨细胞前体的分化和成熟，并诱导破骨细胞凋亡。动物实验[16]结果也初步显示，在关节炎早期阶段，用IL-17中和性抗体治疗可以显著减轻关节炎的严重程度，X线片示关节损伤被明显抑制；组化分析也证实IL-l7抗体抑制关节炎症，阻止关节软骨和骨的进一步破坏。

由于当前制备强直性脊柱炎动物模型的实验技术还不成熟，而有证据表明，Ⅱ型胶原诱导的关节炎鼠模型膝关节局部IL-17高表达可破坏OPG/RANKL平衡，促进骨侵蚀，加重关节破坏，故本研究借此动物模型来探索健脾活血补肾汤治疗强直性脊柱炎骨质破坏的分子药理机制[5]。本实验发现，Ⅱ型胶原诱导CIA模型大鼠血清中致炎因子IL-17及RANKL明显升高，抑炎因子OPG 表达显著受抑，并且增高的IL-17及RANKL与炎症指数呈正相关关系，而降低的OPG水平与炎症指数呈负相关，说明关节炎大鼠发病过程中，细胞因子网络失调发挥重要作用，并与炎症发病有关。

本研究还发现，健脾活血补肾汤各给药组大鼠血清中致炎因子IL-17 及RANKL均较CIA模型大鼠明显降低，而抑炎因子OPG 表达显著升高，表明健脾活血补肾汤能通过降低致炎因子IL-17 及RANKL的表达，升高抑炎因子OPG的表达，而起到延缓炎性关节的骨质侵袭和破坏的作用。但是由于本模型不是强直性脊柱炎的经典模型，故其在保护强直性脊柱炎骨质破坏方面的机制，还有待于其它动物模型成熟后，开展更进一步的研究。

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EffectsofIntensifyingKidneyandSpleenandActivatingBloodCirculationDecoctionontheExpressofIL-17andOPG/RANKLinSerumofCIARat

YU Jianping1，XU Weidong1，2，ZHANG Yanzhen1，et al

1AffiliatedHospitalofJiangxiCollegeofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330006，China

2InsitituteofBasicResearchinClinicalMedicine，ChinaAcademyofChineseMedicalScience，Dongzhimen，Beijing100700，China

ObjectiveTo explore the effects of intensifying kidney and spleen and activating blood circulation decoction on the express of IL-17 and OPG/RANKL in serum of CIA rat.MethodsThe CIA rat model was induced by intradermal of CFA and typeⅡcollagen.A total of 60 Wistar rats were divided into 5 groups randomly，three treatment groups which were given high，medium and low concentration of intensifying kidney and spleen and activating blood circulation decoction respectively，control group which was given normal saline and CIA mode group.After being lavaged for 30 days，the level of IL-17，OPG and RANKL in serum was determined by ELISA kits.ResultsCompared with the model group，the level of IL-17 and RANKL in rat serum of three treatment groups decreased significantly(Plt;0.05)，whereas the serum level of OPG in three treatment groups increased markedly(Plt;0.05).ConclusionThe intensifying kidney and spleen and activating blood circulation decoction could postpone joint bone inflammatory damage through reducing the serum levels of IL-17 and RANKL and increasing the serum level of OPG in the of CIA model rat.

CIA model rats；intensifying kidney and spleen and activating blood circulation decoction；IL-17；OPG；RANKL

10.3969/j.issn.1674-4616.2013.05.004

*国家自然科学基金资助项目(No.81060291/H2708)

△通信作者，Corresponding author，E-mail：jindadong169@163.com

2013-05-11