阿司匹林抵抗与COX-2 基因G765C 单核苷酸多态性临床研究

周 强 易兴阳 池丽芬 池万章 李 强

(瑞安市人民医院,浙江 瑞安 325200)

阿司匹林作为一种有效的抗血小板聚集药广泛应用于心脑血管事件的一级和二级预防中。最近的研究表明,阿司匹林可以分别降低33%和25%的非致命性心肌梗死和脑卒中,同时降低16.7%的外周血管疾病的死亡率[1]。然而一部分长期坚持服用阿司匹林的患者仍然不能避免缺血事件的发生,于是提出“阿司匹林抵抗”这一概念。阿司匹林抵抗发生机制复杂,有资料显示COX -2 基因G765C 单核苷酸多态性可能与其发病有关[2-3]。本研究旨在探讨脑梗死二级预防中阿司匹林抵抗现象及其与COX-2 基因G765C 单核甘酸多态性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年5～11月本院急性脑梗死患者126例作为急性脑梗死组,诊断符合全国第五届脑血管病学术会议通过的诊断标准[4],全部病例均经头颅CT 或MRI 证实。排除标准：近1周内使用抵克立得、传统非甾体抗血小板药及肝素、低分子肝素、华法令等影响血小板聚集功能的药物;有家族或个人出血疾病史;血小板计数＞450×109/L 或＜100×109/L;骨髓增生异常综合征;近期曾行较大外科手术或有严重外伤。选择本院同期非脑卒中患者80例作为非脑梗死组,包括高血压、颈椎病、神经症、抑郁症等,排除标准同上,并通过头颅CT 排除脑梗死和出血。另外选择同期健康志愿者30例作为健康对照组。三组一般资料无显著性差异(P＞0.05),详见表1。

表1 三组一般资料比较(±s)

表1 三组一般资料比较(±s)

1.2 方法

1.2.1 采血方法 急性脑梗死组、非脑梗死组均于入院早餐后一次顿服阿司匹林100mg,连服7 天,同时健康对照组严格按照伦理学原则,签署知情同意书,完全按照自愿原则坚持服用阿司匹林100mg×7 天。三组均服用至最后1 天,次日清晨采用含3.18%枸橼酸钠的0.3mL 真空采血管抽取空腹肘前静脉血2.7mL(1∶9 抗凝),并轻轻混匀进行血小板聚集率测定。同时三组均选用含EDTA 的抗凝管取肘前静脉血3mL 作基因多态性测定。

1.2.2 血小板聚集功能测定 (1)仪器与试剂：美国Helena 公司提供的PACKS-4 通道血小板聚集仪及诱导剂ADP 和AA;(2)血小板聚集率测定：取新鲜血标本先以1000 转/min 离心10分钟,提取富含血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP),剩余血液再以4000 转/min 离心10分钟,制备乏血小板血浆(platelet-prro plasma,PPP),调节PPP 血小板计数为(10～20)×109/L,并用PPP 调节PRP 至(200～300)×109/L。将PRP 225 μL和PPP 250 μL分别加入到2 支比浊管中,在血小板聚集仪中分别将PRP 和PPP 的透光度调节为90 和10;在PRP 中加搅拌棒,比浊管置于37℃温浴3～5分钟后分别将25μL AA 和10μL ADP 加入到PRP 中,使两者的最终浓度分别为0.5mg/mL 和10μmol/L,并记录血小板聚集时间不少于10分钟,整个测定时间在2小时内完成。

1.2.3 阿司匹林抵抗评价标准[5]常规服用阿司匹林7 天后分别以AA 和ADP 作为诱导剂在10 μmol/L ADP 浓度下血小板最大聚集率≥70%,在0.5mg/mL 花生四烯酸浓度下血小板最大聚集率≥20%,符合上述两项标准者称为阿司匹林抵抗(AR),只符合其中之一者称为阿司匹林半抵抗(ASR),均不符合者则为阿司匹林敏感(AS)。

1.2.4 人全血DNA 提取 AXYGEN 公司提供的Axyprep 血基因组DNA 提取试剂盒,采用独特的细胞裂解和血红素/蛋白沉淀技术,结合DNA 制备膜选择性地吸附DNA 的方法提取DNA。

1.2.5 PCR 扩增PCR引物：COX-2上游：5′-CCGCTTCCTTTGTCCATCAG-3′,下游：5′-GGCTGTATATCTGCTCTATATGC-3(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。PCR 反应体系(50μL 反应体系)：Premix Ex TaqTM12.5μL,ROX Reference Dye Ⅱ0.5μL,上下游引物各2μL,模板8μL加双蒸馏水25μL,混匀。PCR 扩增 条件：预变性94℃5分 钟;94℃45 秒,55℃45 秒,72℃45 秒,共35个循环;最后72℃延伸10分钟。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳,EB 染色,紫外灯下观察结果。所有受检者经过模板DNA 的提取后,再经过PCR 扩增出309bp 的DNA 片段,如果患者不存在765G →C 位点突变,则产生限制性内切酶SmuI 的酶切位点,酶切后得到大小为121bp 和188bp 的两个片段,其基因型为纯合GG;若含有765G →C 位点突变,则酶切后得到大小为309bp 的一条片段,基因型为纯合CC;若酶切后既得到309bp,又得到121bp 和188bp 片段者,则基因型为杂合GC型。

1.2.6 PCR 产物酶切消化 取PCR 产物5μL,限制性内切酶SmuI(Fermentas)1μL (1U),10×Buffer1 TangoTM1μL,灭菌去离子双蒸水8μL,反应总体积15μL,37℃酶切16小时终止酶切反应,反应产物用2%琼脂糖凝胶、100V 稳压电泳60分钟,EB 染色,紫外灯下观察结果并照相。

1.3 统计学处理 采用两组资料均数差别的假设检验。计量资料先进行正态性检验,认为近似正态分布后进行方差分析;计数资料采用四格表卡方检验。应用SPSS13.0 统计软件对数据进行统计。

2 结果

2.1 阿司匹林抵抗 急性脑梗死组39例(30.95%)存在阿司匹林抵抗,13例(10.32%)存在阿司匹林半抵抗,74例(58.73%)对阿司匹林敏感。非脑梗死组及健康对照组未发现阿司匹林抵抗及半抵抗现象存在。

2.2 G765C 基因多态性 急性脑梗死组中5例(3.97%)基因型为GC,121例(96.03%)为GG;非脑梗死组3例(3.75%)基因型为GC,77例(96.25%)为GG;健康对照组1例(3.33%)基因型为GC,29例(96.67%)为GG。三组均未见纯合CC型,且三组G765C 基因基因型构成比无显著性差异(P＞0.05)。同时,急性脑梗死组C 等位基因频率与非脑梗死组及健康对照组比较无显著性差异(P＞0.05),详见表2。

表2 三组COX-2 基因G765C 单核苷酸多态性比较

2.3 COX-2 基因G765C 多态性与阿司匹林抵抗的相关性 纯合或者杂合C 等位基因携带者在阿司匹林抵抗和半抵抗组与阿司匹林敏感组比较无显著性差异(χ2=0.922,P＞0.05),详见表3。

表3 急性脑梗死组基因型频率特点

3 讨论

阿司匹林凭借其潜在的抗动脉粥样硬化能力仍然是临床上血管事件一级和二级预防的首选治疗用药。但是随着临床研究的深入,人们发现并不是所有正规服用阿司匹林的患者都能获得一致的抗血小板聚集和防止血栓和栓塞事件发生的临床疗效,于是提出“阿司匹林抵抗”这一概念。阿司匹林抵抗发生率高,在不同的种族人群中存在差异性,为5%～60%[6],且机制复杂,目前尚不清楚。本研究旨在探讨阿司匹林抵抗现象及其与COX-2基因G765C 单核苷酸多态性的有关研究。研究结果提示,阿司匹林抵抗在急性脑梗死人群中发生率普遍较高,约30.95%,与国外报道[6]的数据一致,而在非脑梗死组及健康对照组中未发现阿司匹林抵抗现象的存在。

国外研究认为,COX-2基因G765C单核苷酸多态性可能与阿司匹林抵抗有关[6],国内这方面的报道较少。本组中126例急性脑梗死和80例非脑梗死及30例健康志愿者中分别有5例、3例和2例表现为杂合GC型,余121例、77例和28例表现为纯合GG型,均未见纯合CC 变异型;且C 等位基因出现的频率分别为1.98%、1.88%和1.67%,均与前述学者的研究差距不大,提示中国人群中COX-2 基因G765C 单核苷酸多态性的发生率罕见,而在本研究的急性脑梗死组中,30.95%存在阿司匹林抵抗。因此,COX-2 基因G765C 单核苷酸的多态性不可能参与阿司匹林的抵抗过程。另外,本研究结果证实,急性脑梗死组、非脑梗死组以及健康对照组三组的G765C 基因型及等位基因频率均无显著性差异(P＞0.05),阿司匹林抵抗、半抵抗与敏感三组的G765C 基因型及等位基因频率也无显著性差异(P＞0.05),说明G765C 基因型及等位基因频率与是否脑梗死或者是否有阿司匹林抵抗均无显著关系。引起阿司匹林抵抗的机制复杂,尚需要探讨其它方面引起抵抗的因素,如药物剂量剂型、患者依从性、药物之间相互作用及血小板基因多态性方面机制等等。因此需进一步作大规模、多中心的临床研究。

[1]Antithrombotic Trialists' Collaboration Collaborative meta-analysis of randomized trials of antiplatelet therapy for prevention of death,myocardial infarction and stroke in high risk patients.BMJ,2002,324：71

[2]T.Goodman,P.Sharma,A.Ferro,et al.The genetics of aspirin resistance.Int J Clin Pract,2007,61：826

[3]Timothy Goodman,Albert Ferro,Pankaj Sharma1.Pharmacogenetics of aspirin resistance：a comprehensive systematic review.Br J Clin Pharmacol,2008,66：222

[4]陈伟群,王新德.全国第五届脑血管病学术会议纪要.中华神经科杂志,2000,33(4)：252

[5]Gum P A,Kottke -Marchant K,Welsh P A,et al.A prospective,blinded determination of the natural history of aspirin resistance among stable patients with cardiovascular disease.J Am Coll Cardiol,2003,41：961

[6]Sanderson S,Emery J,Baglin T,et al.Narrative review：aspirin resistance and its clinical implications.Ann Intern Med,2005,142：370