金银花中绿原酸的微波提取工艺研究

何 培，丁慧娟，刘芷成，刘 欢，申湘忠

(湖南人文科技学院化学与材料科学系，湖南娄底417000)

金银花又名忍冬花、银花、双花、茶叶花等，为忍冬科植物，是我国常用中药，金银花常用于治疗温病发热、热毒血痢、痈疡等症，亦用于风热感冒、支气管炎等病症[1]。现代药理研究表明，金银花具有抗病原微生物、抗炎、抗生育、解热、保肝、止血、降血脂、抗氧化、免疫调节等作用，临床主要用于治疗多种感染、各种炎症、高热症、高血脂症、肿瘤放疗等[2]。金银花中富含多种对人体健康有益的营养物质[3]，诸如绿原酸、异绿原酸、挥发油、咖啡酸、黄酮化合物、三萜皂苷、木犀草素及无机元素等，具有很高利用价值。金银花的主要成分为绿原酸、类黄酮，而绿原酸是金银花主要的抗菌成分，绿原酸含量的高低是目前衡量金银花品质优劣的指标之一[4]。提高金银花制剂中绿原酸含量对保证金银花制剂的药效具有重要作用。

目前，绿原酸的提取多采用水煎煮、醇回流、动态浸提法、超声波法和微波法等[5-10]。国内外对绿原酸不同提取工艺的评价众说纷纭，但是鉴于中国古老的煎药方式，认为水煎煮法对提取物药有提取时间过长的缺点。近年来，微波在植物有效成分提取过程中的研究发展很快，由于微波具有穿透性和由内向外的加热方式等优点，在现代活性成分提取中的运用越来越广泛。为提高金银花的利用率，结合现代提取方式[11-13]，本文采用微波预处理水浴加热法进行金银花中绿原酸的提取实验，并使用紫外分光光度计测定绿原酸的浓度，运用正交试验对较优的提取方法进行了研究。并探讨了乙醇浓度、提取时间、温度、醇用量、水用量、微波处理时间等6个因素对提取金银花中绿原酸含量的影响。通过正交实验对金银花中绿原酸的提取进行比较分析以确定金银花中绿原酸的微波提取的最佳工艺。

一 实验部分

(一)仪器和试剂

紫外可见分光光度计(UV-2501PC)，日本岛津公司生产;电子天平(FA2004A)，上海良平仪器仪表有限公司生产;数显恒温水浴锅(HH-2)，江苏金坛市亿通电子有限公司生产;微波炉(WD800)，长沙超扬电器贸易有限公司生产;循环水式真空泵(SHZ-D)，巩义市予华仪器有限责任公司生产;微型植物试样粉碎机(XY-500A)，浙江永康寿松仪器有限公司生产;绿原酸标样，长沙市有机试剂厂生产;无水乙醇(AR)，衡阳市凯信化工试剂有限公司生产;盐酸(AR)，株洲石英化玻有限公司生产。

(二)实验方法

1．标准曲线测定

准确称取绿原酸标准品0．2500g，用蒸馏水定容至250ml容量瓶中，然后准确量取绿原酸标准溶液 0．0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0ml，分别用蒸馏水定容至50ml容量瓶，将溶液摇匀后配成各种标准浓度，用蒸馏水做参比液，采用UV-2501紫外可见分光光度计进扫描，确定绿原酸最大吸收波长。在最大吸收波长下测定不同浓度的绿原酸的吸光度。

2．金银花中绿原酸的提取

将100g市售金银花洗净，在电热鼓风干燥箱中干燥时间为24h。将干燥好的金银花用微型植物试样粉碎机粉碎，直至过55目筛，保存在试剂瓶中，称取2．0g预处理好的金银花粉末置于100ml烧杯中，边滴乙醇溶液边搅拌使之湿润均匀，然后铺平静置10min，使溶液充分渗入金银花组织内。向预处理好的金银花粉末中加水，恒温提取，将提取液抽滤。将滤液加水定容到250ml的容量瓶中定容，再量取2ml的溶液加水定容到50ml的容量瓶中，然后在设定波长下测定吸光度及浓度。

(三)单因素实验

1．微波预处理时间对绿原酸浓度的影响

在固定其它因素(乙醇浓度、乙醇用量、浸提水用量、浸提时间、浸提温度)的条件下，分别在微波炉中对金银花粉末处理 40s、50s、60s、70s和80s，然后水浴加热，提取液定容，分别测定吸光度及浓度。

2．乙醇浓度对绿原酸浓度的影响

在固定其它因素条件下，分别使用60%、70%、80%、90%和95%的乙醇对金银花粉末进行预处理，然后水浴加热，提取液定容，测定吸光度及浓度。

3．乙醇用量对绿原酸浓度的影响

在固定其它因素的条件下，分别采用2、3、4、5和6倍量的乙醇对金银花粉末进行处理，然后水浴加热，提取液定容，测定吸光度及浓度。

4．浸提水用量对绿原酸浓度的影响

在固定其他因素的条件下，分别采用10、15、20、25和30倍的水量进行水浴浸提，提取液定容，测定吸光度以及浓度。

5．浸提时间对绿原酸浓度的影响

在固定其他因素的条件下，分别采用40min、50min、60min、70min和80min的水浴时间进行浸提，提取液定容，测定吸光度及浓度。

6．浸提温度对绿原酸浓度的影响

在固定其他因素的条件下，分别采用50℃、60℃、70℃、80℃和90℃的水浴温度进行浸提，提取液定容，测定吸光度及浓度。

(四)正交实验

1．微波预处理条件的正交实验

根据单因素实验的结果，固定浸提条件，对预处理的3个因素(乙醇浓度、乙醇用量、微波预处理时间)各取3个水平，进行L9(33)正交实验(表1)，以绿原酸浓度作为指标进行考察。

表1 微波预处理因素水平表

2． 浸提条件的正交实验

根据单因素实验的结果，固定微波预处理条件，对浸提实验的3个因素(浸提时间、浸提水用量、水浴温度)各取3个水平，进行L9(33)正交实验(表2)，以绿原酸浓度作为指标进行考察。

表2 浸提条件因素水平表

二 结果与分析

(一)标准曲线的绘制

对绿原酸标准品的扫描见图1，可以看出绿原酸的最大吸收波长在324．0nm处。

图1 绿原酸标准溶液紫外扫描图

以标准品的浓度C(μg/ml)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线如图2。

图2 绿原酸标准工作曲线

依据此标准曲线可得回归方程Y=AX+B

式中:A=0．0525 B=-0．0022

X—绿原酸的浓度(μg/ml)，Y—吸光度，R2=0．9999，说明绿原酸浓度在 0-20 μg/ml范围内，吸光度与绿原酸浓度的线性关系良好。

(二)单因素实验结果与分析

1．微波预处理时间对绿原酸提取的影响

不同微波预处理时间对绿原酸提取的影响见图3。

图3 微波预处理时间对绿原酸提取的影响

从图3可以看出，当微波预处理时间为60s时，绿原酸的浓度最高，提取效果最好。小于60s时，处理时间太短，渗透到细胞的乙醇不能完全汽化，组织破坏不完全;大于60s时，会破坏细胞结构，影响绿原酸的产量。

2．乙醇浓度对绿原酸提取的影响

用不同乙醇浓度对金银花进行处理，不同浓度乙醇对绿原酸提取的影响见图4。

图4 乙醇浓度对绿原酸提取的影响

由于不同浓度的乙醇溶液对金银花细胞膜的渗透效果是不同的，渗透细胞膜效果越好，微波对细胞组织的破坏效果越好，绿原酸的产量也就越好。从图4可以看出，用浓度为80%的乙醇溶液处理金银花，得到的绿原酸浓度最高，由此也可以看出浓度为80%的乙醇溶液对金银花细胞膜的渗透效果最好。

3．乙醇用量对绿原酸提取的影响

用不同用量的同浓度乙醇溶液对金银花进行处理，实验结果见图5。

图5 乙醇用量对绿原酸提取的影响

当乙醇用量少时，金银花粉末没有很好地被浸湿，不能达到很好的处理效果;当乙醇用量过多时，过多的乙醇在蒸发时会消耗一定的微波能，使渗透入细胞内的乙醇溶液挥发不够充分，从而影响绿原酸的提取。从图5可以看出，当乙醇用量为5倍量时，绿原酸的浓度最高，所以用5倍量的乙醇提取效果会更好。

4．浸提水用量对绿原酸提取的影响

不同浸提水用量对绿原酸提取的影响见图6。

图6 浸提水用量对绿原酸提取的影响

在一般的提取实验中，加大溶剂的用量可以提高提取率。但是绿原酸比较特殊，在加水的过程中，PH会慢慢增加，会有部分的绿原酸分解，从而影响绿原酸的提取率。从图6可以看出，当提取水的用量为15倍量时，绿原酸的浓度最高，绿原酸提取的效果最好。

5．浸提时间对绿原酸提取的影响

浸提时间对于绿原酸的提取有一定的影响，浸提时间对绿原酸提取的影响见图7。

图7 浸提时间对绿原酸提取的影响

浸提时间与绿原酸在水中的溶解度有关，当绿原酸的溶解度达到饱和时，延长浸提时间不会增加绿原酸的浓度，反而绿原酸在光照下会有部分的分解，随着时间的增加，绿原酸的浓度会慢慢降低。从图7可以看出，当浸提时间小于60min时，绿原酸的浓度不断提高，到60min时达到最优，大于60min后则会有部分绿原酸分解而使绿原酸浓度慢慢降低。

6．浸提温度对绿原酸提取的影响

不同浸提温度对绿原酸提取的影响见图8。

图8 浸提温度对绿原酸提取的影响

升高浸提温度，可以提高分子的热运动，从而提高绿原酸的提取效率。但是绿原酸的性质表明:温度过高时，绿原酸容易分解。从图8可以看出，当浸提温度小于70℃时，升高温度有利于绿原酸的提取，绿原酸的浓度在不断上升;当浸提温度为70℃时，绿原酸的浓度达到最大值;当浸提温度大于70℃时，绿原酸的浓度在不断减小，说明绿原酸在不断地分解。实验得出绿原酸的最优浸提温度为70℃。

(三)正交实验结果与分析

1．微波预处理实验的正交实验

在单因素实验的基础上，选取预处理中影响绿原酸提取的3个因素(微波预处理时间、乙醇浓度和乙醇用量)进行3因素3水平正交实验。实验结果见表3。

由表3中R值的大小可以看出，在金银花中绿原酸微波提取的预处理实验部分，影响最大的条件为C(乙醇用量)，其次是A(乙醇浓度)，最后是B(微波预处理时间)。对K值进行分析，得出最优的微波预处理实验组合为A2B2C1，即乙醇浓度为80%，微波预处理时间60s，乙醇用量为4倍量。

表3 微波预处理正交实验表

2．浸提条件的正交实验

在单因素实验的基础上，对浸提条件中影响绿原酸提取的3个因素(浸提温度、浸提时间和浸提水用量)进行3因素3水平的正交实验。实验结果见表4。

表4 浸提条件正交实验表

由表4中R值的大小可以看出，在金银花中绿原酸的微波提取实验的浸提实验部分，影响最大的条件为D(浸提水用量)，其次为E(浸提水浴温度)，最后是F(浸提时间)。对K值进行分析，得出最优的浸提实验组合为D2E2F1，即浸提水用量为 15倍，浸提水浴温度为 70℃，浸提时间为50min。

3．最优条件的验证实验

根据对微波预处理条件的正交实验和浸提条件的正交实验，可以得出金银花中绿原酸的微波提取实验最佳的条件为:加入4倍量80%的乙醇溶液，微波预处理60s，然后加15倍量的蒸馏水在70℃的水浴温度中提取50min，并进行绿原酸的微波提取实验，得到绿原酸浓度为16．6758 mg·L-1，绿原酸的含量为8．34mg·g-1。

三 结论

用微波预处理水浴浸提法对金银花中的绿原酸进行提取，用紫外可见分光光度计进行结果测量，通过对预处理实验中的3个因素和浸提实验中的3个因素进行研究，确定了微波法提取绿原酸的最佳条件:4倍量80%的乙醇、微波预处理60s、15倍量的蒸馏水、水浴温度为70℃、浸提时间为50min。在此最佳条件下进行提取实验，提取得到的绿原酸含量为8．34mg·g-1。采用微波预处理法提取金银花中的绿原酸比传统提取的方法得到的绿原酸的含量要高。实验得到的工艺可供工业生产作为参考。

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