9 种植物粗多糖体外降脂及抑制非酶糖基化活性的研究

王文君，欧阳克蕙，许文凤，徐明生，上官新晨，蒋 艳

(江西农业大学 江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌330045)

多糖是普遍存在于自然界中的由许多相同或不同的单糖通过糖苷键连接在一起的多聚化合物，不仅是维持生命活动正常运转的基本物质，其生物活性更具有广泛的应用价值。研究显示，植物多糖具有包括免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、保护肝脏以及非酶糖基化等生理功能，且对机体毒副作用小。因此，对植物多糖的研究开发已经成为热门领域。如香菇多糖、灵芝多糖、云芝多糖已经在国内外临床上应用广泛。但是由于灵芝等中药材价钱昂贵，经济效益较差。于是人们开始寻求更为实用的植物来源。

随着生活水平的提高患高血脂、高血糖等心血管疾病的人群越来越多，寻找预防治疗这些疾病的药物也就成为了社会的热点。蛋白质非酶糖基化反应在糖尿病及其血管并发症的发生发展中具有重要的意义。非酶糖基化(nonenzymatic glycosylation，NEG)是蛋白质与羰基化合物发生的反应，反应最终形成一系列不可逆的糖基化终产物(advanced glycosylation end products，AGEs)［1］。AGEs 可以与机体中的蛋白质发生能够改变蛋白质的生理活性的交联反应，从而引起蛋白质分子层面上的一系列机体病理生理上的状态改变。同时有报告称AGES 可能是引发粥样动脉硬化的关键产物［2］。如何合理的抑制蛋白质的非酶糖基化反应已经成为了近年来国内外医学药物健康等领域研究的热点［3］。在国外医学药物学当中已经得到证实的是，药物氨基胍可以有效的抑制蛋白质的糖基化反应［4］。目前的一些研究表明，多糖类化合物以及黄酮类化合物具有抗氧化，抗癌症肿瘤，抗心脑血管疾病等的多种有益的生物学作用，且对AGEs 的生成也有一定抑制作用，而多糖类化合物以及黄酮类化合物广泛生存于多种天然植物中。

青钱柳［Cyclocarya paliurus (Batal.)Iljinskaja］、银杏(Ginkgo)、绿茶、芦荟(Aloe)、荷叶(Folium Nelumbinis)、蛇接骨草［Gynura procumbens (Lour)Merr］、菝葜(Smilax china)、鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)、三叶草(Trifolium)等9 种植物都属于自然中常见的实用性较强的天然植物，有些还是药食同源的植物。本文对这9 种植物粗提总多糖的体外降脂活性和其对非酶糖基化的抑制作用进行了相应的体外研究，以期能为其药用价值的开发利用提供有用的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青钱柳、银杏、绿茶、芦荟、鱼腥草、荷叶、蛇接骨草、菝葜和三叶草都来源于江西农业大学植物园。

1.2 主要试剂

氢氧化铝、聚乙烯醇、三油酸甘油酯、乙二醛均购自天津永大化学试剂，脂肪酶、氨基胍和标准牛血清白蛋白购片Sigma 公司。

1.3 主要仪器

电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;RE－52A 旋转蒸发器，上海亚荣生物化仪器厂;SHEIII 型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂;SP－754PC 型分光光度计，上海光谱仪器有限公司;960 型荧光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;KQ3200DB 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;HH－6 电热恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 多糖的提取 植物烘干至恒重后粉碎过70 目筛，称取100 g 用石油醚按料液化比1∶10 浸提过夜脱脂脱色，蒸干备用。

准确称取处理后的样品各50 g，用石油醚(料液比1∶10)在室温下脱水脱色12 h。用循环真空泵抽滤，取滤渣，晾干。然后用蒸馏水超声辅助水提(料液比1∶20，60 ℃，1 h，100 W)，再次过滤，取滤液。用旋转蒸发仪将滤液(65 ℃)真空浓缩至约50 mL。

其次将浓缩物以体积比1∶3 加无水乙醇沉淀，将溶液在4 000 r/min 转速下离心15 min，得沉淀物抽干。最后，用真空冷冻干燥机将抽干物质干燥完全，备用。用蒸馏水将干燥完全的样品定容至100 mL 容量瓶，取5 mL 再定容至50 mL 容量瓶，即为样品溶液，备用。

1.4.2 体外降脂实验 降脂实验根据霍世欣等［5］稍有修改。脂肪酶催化脂肪分解，生成脂肪酸，以酚酞做指示剂，用0.05 mol/L NaOH 溶液滴定。通过比较有无抑制剂(提取液)加入的情况下，脂肪酶活性的差异，可得提取物对脂肪酶的抑制率，体现抗氧化活性的大小，并与含量进行相关性比较。

抑制率=抑制脂肪酶活性/脂肪酶活性×100%(1)采用脂肪酶活性测定法:

(1)取100 mL 三角瓶，加入5 mL 0.025 mol/l 磷酸缓冲液(pH7.4)和4 mL 聚乙烯醇三油酸甘油酯乳化液(0.22 g/mL 聚乙烯醇，油酸甘油酯1 mL 混合，高速搅拌均匀，得乳白色乳化液)作为底物，置于37 ℃水浴中反应10 min。加入1 mL 脂肪酶(2 mg/mL)，准确反应15 min 后，加体积分数为95%乙醇终止反应。加酚酞2 ～3 滴，用0.05 mol/L NaOH 标准溶液滴定至微红色，平行实验3 次。

综上所说，笔者认为在语文课堂上创造性思维的培养与语文教学不仅可以有机结合，而且可以使传统语文教学真正成为创新教学。面临经济时代的来临，一个国家和民族的创新能力和水平决定着一个国家和民族的地位和发展速度，创新能力和水平的提高又深深依赖于一个国家和民族的创新教育能否顺利实现。而语文课堂是其中最为基础的一个重要环节，在语文课堂上培养学生的创新型思维，提高其创新能力，加快创新教育的实施和发展壮大，是极其重要而有深远意义的。

(2)按上述测定方法加入底物37 ℃水浴保温10 min 后，在体系中加入1 mL 脂肪酶，后续相同。空白实验为加入底物后37 ℃水浴保温10 min，终止反应，加入1 mL 酶液和1 mL 样品提取液，滴定步骤同上。

1.4.3 糖基化实验 在蛋白质非酶糖基化反应体系中加入粗提黄酮进行药物干预实验，15 d 中每3 d 用荧光光度计测定荧光值，绘制动态曲线，加氨基胍做阳性对照，加水做阴性对照，进行抑制能力分析;以氨基胍作参比，计算粗提物对糖基化终产物AGEs 的抑制率，并与含量进行相关性分析。

(1)反应液配制:根据文献［6］稍加修改，将乙二醛(GXL)12 mg/mL，牛血清白蛋白(BSA)20 mg/mL 和EDTA 1 mol/L，在pH7.4 的磷酸缓冲液(PBS)0.2 mol/L 中混合而成，备用。

(2)蛋白质非酶糖基化的药物干预实验:根据文献［1］的方法稍加修改，将提取液1mL(浓度为1 mg/mL)与PBS 1 mL 在90 ℃下混合，40 min(以去除乙醇)，再加入反应液1 mL，37 ℃水浴避光孵育1、3、6、9、12、15 d，时间分6 批，重复3 份。

氨基胍1 mL(0.1 mg/mL)与反应液做阳性对照，蒸馏水1 mL 与反应液做空白对照。

(3)抑制率的测定:根据糖基化终产物有自发荧光的特性，采用荧光法测定荧光值，将抑制率与含量进行相关性分析。测定条件参考刘乃丰等［7］:激发波长365 nm，发射波长440 nm，狭缝10 nm，灵敏度1。

表1 9 种植物粗多糖降脂效果Tab.1 Hypolipemic activity of nine kinds of plant polysaccharides %

其中I:抑制率;A:空白对照荧光强度;B:样品荧光强度。

1.5 统计分析

各项指标以平均数±标准差表示，数据统计分析时采用DPS 数据处理系统(v3.01 专业版)。

2 结果与分析

2.1 体外降脂实验测定结果

由表1 可知，不同植物粗多糖抗氧化的活性相关很大，其中抑制胰脂肪酶活性最强的为蛇接骨草的提取物，达到78.41%，最低的是菝葜，其抗氧化活性仅为17.67%，两者差异极显著(P ＜0.001)。其他植物粗多糖的抗氧化活性大小依次为绿茶、芦荟、荷叶、银杏、鱼腥草、三叶草和青钱柳。

2.2 非酶糖基化实验测定结果

由表2 可知，在1 ～15 d，随着时间的延长，荧光强度逐步增高，各提取物的抑制能力增强。在15 d时，抑制糖基化反应能力最强的是芦荟粗多糖提取物，其抑制率达到96.51%，其余的提取物中，青钱柳多糖、绿茶多糖的抑制率亦分别达到95.76%、96.51%，与氨基胍相比差异显著(P ＜0.05)。另外荷叶多糖达到87.08%、菝葜多糖达到89.64%，与氨基胍抑制率相当。

表2 9 种植物粗多糖抑制糖基化结果Tab.2 Results of nonenzymatic glycosylation activity of nine plant crude polysaccharides %

3 讨论

多糖对脂肪酶活性抑制作用测定的原理是，根据脂肪酶催化脂肪水解，生成脂肪酸和甘油。产生的脂肪酸可用标准碱液滴定，从而做定量测定［8］。在本研究中，对比未加植物粗多糖实验组，加入多糖实验组消耗的NaOH 减少，说明脂肪酶催化产生的脂肪酸减少，也可推断脂肪酶活性受到抑制。在本实验中发现，不同植物的粗多糖对脂肪酶活性一定抑制作用，能减少体内游离脂肪酸的产生，提示多糖可能通过抑制脂肪酶活性降低血脂水平，从而在一定程度上能预防心血管相关疾病。

蛋白质糖基化在糖尿病血管并发症的发生占有非常重要的地位。蛋白质和葡萄糖在体内可通过发生非酶促反应形成Schiff 碱和Amadori 产物等早期产物，进而经过一系列步骤形成不可逆的非酶糖基化终末产物［9］。研究表明，AGEs 可与蛋白质发生交联，沉积在长寿蛋白上，引起一系列病理生理改变，表现为造成动脉粥样硬化、视网膜微血管瘤形成和肾病的发生等［10］。有研究表明，非酶糖基化反应除会引起糖尿病并发症之外，还可以通过阻碍与血红蛋白结合氧的释放和减少血流量两方面造成组织假性缺氧并加速血糖升高［1］。

多糖作为一种重要的活性成分，具有很强的抗氧化作用，可清除自由基，调节血糖和血脂的功能［11］。本研究对9 种天然植物的粗多糖提取物进行了体外降脂和非酶糖基化的研究。发现绿茶、芦荟和蛇接骨草的体外降脂作用比较明显;而非酶糖基化的研究表明，绿茶、芦荟、青钱柳和菝葜对非酶糖基化的抑制率较高，且各种植物多糖提取物对非酶糖基化的抑制率都随着时间的延长，各提取物的抑制能力增强，与文献［12］报道一致。尽管体外试验表明9 种植物的粗多糖具有体外降脂和对非酶糖基化抑制作用，但对AGEs 的抑制作用机制目前研究的不是很清楚，还有待进一步研究。

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