人参皂甙Rb1 减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤的实验研究

黄 飞，李亚男，尹 飞，赵东旭，朱庆三

脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemiareperfusion injury，SCII)一直是神经科学研究的难点之一，SCII 是指在某种损伤因素作用下脊髓经过一定时间缺血后得到血液再灌注后出现明显的功能障碍，甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡的现象［1-2］。SCII 的主要损伤因素在于再灌注后的继发性损伤，决定了SCII 的预后。因此，保护脊髓神经元，避免脊髓水肿，是治疗SCII 的关键所在［3-4］。目前SCII 的临床防治方法主要包括缺血预适应，低温、低流、低压再灌注，药物治疗和物理治疗，但是都不能从根本上改善SCII 的预后［5-7］。而且上述治疗手段均以对症治疗为主，患者住院时间长，花费大，给家庭和社会带来沉重的负担。因此，找到一种切实有效、毒副作用小的治疗方法具有重大的社会意义和经济价值。

人参作为中国传统中药，具有药性温和、药理作用广泛的特点，一直广泛应用于临床。已有的研究发现，人参发挥作用的主要成分之一为人参皂甙，其是从人参在地表以上茎叶中提取的有效成分，目前提纯的单体成分有50 多种［8-9］。近年来，我国学者尝试将人参皂甙应用于神经系统疾病及损伤当中，取得了一定疗效，但尚缺乏人参皂甙对神经系统保护作用的机制研究。在人参皂甙的多种单体中，人参皂甙单体Rb1 具有突出的抗氧化清除自由基、抗细胞凋亡和改善心肌缺血再灌注损伤等作用［10-11］。而SCII 中也涉及过量氧自由基产生和细胞凋亡等因素［12-13］，因此推测人参皂甙Rb1 可能对SCII 有一定的治疗意义。因此本部分研究拟阐明人参皂甙Rb1 对SCII 的干预作用。

1 材料与方法

1.1 动物

健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，体重(220±20)g，吉林大学动物实验中心提供，许可证为SCXK(吉)2008-0005。适应性饲养3 d。每天12 h 光照时间，自由取食饮水。

1.2 药物

人参皂甙Rb1(纯度99.9999%)为吉林大学化学实验室提供，实验中应用0.9%生理盐水将人参皂甙Rb1 配置浓度为5 mg/mL 的溶液待用。

1.3 模型的建立

1.3.1 SCII 模型

将大鼠麻醉、固定，于大鼠的左侧肋骨下缘中线做3 cm 左右切口，找到左侧肾脏位置，进而确认肾动脉，沿肾动脉寻找腹主动脉，于肾动脉分支水平以下分离腹主动脉，用10 g 标准动脉夹持续结扎60 min，期间切口用生理盐水纱布覆盖。60 min 后取出动脉夹，局部撒青霉素粉2×105单位后关闭腹腔。

1.3.2 假手术组模型

过程同SCII 模型，但是不需结扎腹主动脉，同样切口用生理盐水纱布覆盖持续60 min，然后局部撒青霉素粉2×105单位后关闭腹腔。

1.4 实验分组和药物治疗方案

SD 大鼠72 只，随机分为假手术组、实验对照组和实验组，每组24 只。在构建SCII 模型后记为0点，24 h 后设为1 d。分别在1 d、3 d、5 d 和7 d 这4个时间点评估大鼠神经功能及处死动物检测相应指标。假手术组，大鼠后续不予任何处置;实验组，SCII 模型大鼠在构建模型24 h 后给予腹腔注射10 mg/kg的人参皂甙Rb1，每天1 次，共7 d;实验对照组，相同时间点给予等体积生理盐水腹腔注射。

1.5 评价方法

1.5.1 神经功能评分

采用Basso Beattie-Bresnahan(BBB)运动功能评分法［14］对3组模型进行后肢神经功能评分并记录，满分21 分，最低分0 分。

1.5.2 HE 染色

将脊髓组织固定于福尔马林缓冲液中，无水酒精脱水后，石蜡包埋，横断面切成4 μm 薄片，苏木精、伊红染色，光镜下观察。

1.5.3 原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling technique，TUNEL)法染色

各组各时间点每只大鼠的连续切片中随机抽取，做TUNEL 法染色。TUNEL 法染色过程如下:①石蜡切片，方法同HE 染色。②加入TUNEL 反应液37 ℃孵育60 min，加入Converter-POD 37℃孵育30min，DAB 显色，树脂封片。

光学显微镜镜下观察凋亡细胞并计数，通过计算凋亡细胞的百分比确定细胞凋亡情况。

1.6 统计学处理

所有实验重复3 次。数据用SPSS 17.0 统计软件处理，计量资料结果用±s 表示，组间各对应指标差异用方差分析，P＜0.05 为有显著性差异。

2 结 果

2.1 BBB 评分

假手术组大鼠双后肢BBB 评分为21 分。实验对照组BBB 评分显著低于假手术组，随着时间推移，后肢功能逐渐恢复，BBB 评分逐渐上升，但在各个时间点仍低于假手术组，说明模型成功。实验组与实验对照组比较可见BBB 的分值显著增加(见图1)。

2.2 HE 染色

病理切片HE 染色，光学显微镜观察大鼠脊髓组织形态变化及细胞改变情况(见图2)。假手术组组织结构清晰，细胞形态没有发生改变，神经元大而多角，细胞核清晰居中，胞浆丰富。实验对照组部分神经元受损，一些神经元胞体膨大，结构不清，可见细胞胞核固缩，组织间充血，细胞核结构不清，部分可见凋亡小体。实验组与实验对照组比较受损的神经元数目减少，组织充血减轻。

2.3 TUNEL 法检测细胞凋亡

图1 各组大鼠后肢BBB 评分情况的比较Fig.1 BBB scores of rat hindlimbs in different groups

图2 大鼠脊髓组织HE 染色(×400)Fig.2 HE staining of rat spinal cord tissues in 3 groups(×400)

图3 各组大鼠脊髓组织TENUL 染色细胞凋亡情况(×400)Fig.3 TUNEL staining of rat spinal cord tissues in various groups(×400)

图4 TUNEL 染色检测各组大鼠脊髓细胞凋亡率Fig.4 Rate of cell apoptosis in various groups measured by tunnel staining

TUNEL结果(见图3，4)显示凋亡细胞的细胞核固缩，颗粒深染，形态不规则。其中假手术组细胞凋亡较少，实验对照组的细胞凋亡率较高，给予人参皂甙Rb1 干预后，细胞凋亡率与实验对照组相比显著降低(P＜0.05)。

3 讨 论

SCII 是指在某种损伤因素作用下脊髓经过一定时间缺血后得到血液再灌注后出现明显的功能障碍，甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡的现象，一直是神经科学研究的难点之一。因此，保护脊髓神经元，避免脊髓水肿，是治疗SCII 的关键所在。有研究表明在多种动物模型上夹闭胸主动脉、腹主动脉可造成相应节段的脊髓缺血，人体内主动脉夹闭同样会导致脊髓缺血的发生［15］。本研究中采用了肖博晗等［16］改进的夹闭大鼠腹主动脉方法建立SCII 模型，实验技术成熟，操作简便，损伤效果确实可靠。

SCII 的机制尚不明确，损伤过程可分为直接损伤和间接损伤，其发生、发展可能为多因素联合作用。直接损伤主要发生在缺血过程中，再灌注损伤多为间接性损伤，间接损伤又称为继发性损伤，主要损伤因素为内源性物质的激活。相关研究认为，氧自由基介导的脂质过氧化反应、钙离子超载、细胞凋亡、兴奋性氨基酸释放在SCII 中发挥了重要作用［17］。目前SCII 在临床中的主要治疗手段包括缺血预适应，低温、低流、低压再灌注，药物治疗以及物理治疗等［18-19］，但是都不能从根本上杜绝瘫痪的发生。而且这些治疗方法只能以对症支持为主，患者住院时间长，花费大，给家庭和社会带来沉重的负担。

药物治疗方面，临床上尚无明确有效的治疗药物。近年来有一些新型药物相继被报道有助于SCII神经功能恢复，但治疗后神经功能改善效果均不确定，未见临床广泛应用报道。目前在脊髓损伤早期，常用的药物是糖皮质激素，其可减轻炎症反应和脊髓损伤;而在脊髓损伤后期尚无安全有效的治疗药物，目前的相关研究热点是应用神经再生因子和神经营养因子如神经生长因子(nerve growth factor，NGF)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作为改善神经功能或作为康复辅助用药，但尚未取得明显治疗效果。因此，开发研制一种安全有效解决SCII 的药物一直是临床工作研究的重点之一。

近年来，我国学者尝试将人参皂甙应用到神经系统疾病及损伤的治疗中，发现人参皂甙在脑缺血、血管性痴呆、癫痫等疾病方面可发挥神经保护作用［20-21］。而目前国内外文献关于应用人参皂甙治疗SCII 的报道鲜见。因此，本研究利用大鼠SCII 模型深入研究了人参皂甙Rb1 对SCII 的保护效应及其可能机制。

实验显示利用人参皂甙Rb1 干预SCII 模型大鼠，可显著改善大鼠后肢功能，实验组的BBB 评分在各时间点均显著高于对照组。HE 染色光镜下观察实验组的神经细胞形态明显好于对照组。同时，TUNEL 法检测细胞凋亡发现，实验组的细胞凋亡率明显少于对照组。以上结果提示人参皂甙Rb1 可改善SCII 大鼠的神经功能，减轻SCII 导致的神经元受损，减少脊髓细胞凋亡。具体机制尚需进一步研究。

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