高效液相色谱－电喷雾串联质谱法同步检测污水处理厂活性污泥中12种抗生素

雷晓宁，鲁建江，刘子龙，童延斌，李姗蔓

（石河子大学化学化工学院／新疆兵团化工绿色过程重点实验室，石河子832003）

抗生素（antibiotics）是一类大量应用于人和动物感染性疾病治疗的广谱药物，同时也以亚治疗剂量长期添加于动物饲料中，作为生长促进剂促进动物的生长发育［1－2］。在我国部分地区（如珠江三角洲），四环素类 （tetracycline，TCs）、喹诺酮类 （quinolones，QNs）及磺胺类（sulfanilamide，SAs）抗生素的人均日使用量比瑞士、澳大利亚等发达国家高出1～3个数量级［3］。人畜服用的抗生素类药物大多不能被充分吸收利用而随排泄物进入污水或直接排入环境。虽然许多抗生素的半衰期较短，但由于其被频繁地使用并进入环境，导致其形成假持续现象［4－5］。环境中持续存在的抗生素不仅可以选择性抑杀一些环境微生物，而且能够诱导一些耐药菌群或抗性基因的产生，从而导致其特殊的生态毒理效应［5］，对人类健康和整个生态系统构成了长期潜在的威胁［6］。

污水处理厂被认为是多种污染物消除的主要场所之一［7－9］，进入污水处理厂的抗生素一部分随出水进入地表水中，另外也有一部分在处理过程中进入到活性污泥中；污泥中的抗生素很难被降解，因而对抗生素具有一定的蓄积作用。TCs、QNs及SAs三类抗生素已在城市污泥中被频繁检出［10－11］，且检出浓度可高达 mg／kg级［12］。

对于活性污泥中抗生素类药物的检测方法仅限于一种或一类抗生素，有必要建立一种同步测定污泥中多类抗生素的分析方法。在基质复杂的活性污泥样品处理过程中，提取步骤对样品中目标物的回收率和基质效应起到关键作用。固体样品中有机物提取的常用方法是超声萃取技术（USE）［13－15］和加速溶剂萃取（ASE）［16－17］，而 ASE技术使用昂贵，在我国尚未普及［18］。

抗生素类药物残留检测的方法较多，主要有高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱－质谱联用法（LCMS）、液相色谱－串联质谱联用法（LC－MS／MS）等［19］，其中高效液相色谱－串联质谱方法（HPLC－MS／MS）灵敏度高、选择性好，能够对复杂环境基质中的低浓度目标物进行很好的定性与定量，已成为检测的首选技术［20－21］。

本文应用USE技术、联合固相萃取（SPE）及HPLC－ESI－MS／MS技术建立了高效液相色谱－电喷雾串联质谱法（HPLC－ESI－ms／ms）同步检测污水处理厂活性污泥中3类共12种抗生素类药物的方法。该方法选择性强、灵敏度高、重现性较好，可满足活性污泥中抗生素类药物残留检测的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1仪器

Finnigan Surveyor液相色谱系统（Thermo E－lectron，USA）和Finnigan TSQ Quantum Discovery MAX三重四极杆质谱分析仪；24孔固相萃取装置（美国Supelco公司）；超声萃取仪（上海超声波仪器厂）；LGJ－12型冷冻干燥机（北京博医康公司）；Milli－Q纯水仪（美国 Millipore公司）。

1.1.2试剂

甲醇和乙腈（色谱纯，美国 Tedia公司），甲酸（纯度为98%，美国Fluka公司），乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA）为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

四环素类抗生素药物标准品（TCs）具体如下：

土霉素（oxytetracycline，OTC），四环素（tetracycline，TC），金霉素（chlortetracycline CTC）与强力霉素（doxycycline，DC）；喹 诺 酮 类 抗 生 素 药 物 标 准 品（QNs）：环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）与洛美沙星（lomefloxacin，LOM）；磺胺类抗生素药物标准品（SAs）：磺胺嘧啶（sulfadiazine，SDZ）、磺胺甲基异恶唑（sulfisoxazole，SIZ）、磺胺醋酰（sulfacetamide，SAAM）与磺胺甲恶唑（sulfamethoxazole，SMZ）；替代物标准品：环丙沙星－d8（Ciprofioxacin－d8，CIP－d8），磺胺甲恶唑－d4（sulfamethazine－d4，SMZ－d4），地美环素（demeclocycline，DMC）均购自Dr Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 标准溶液及缓冲溶液配制

单标储备液 （100mg／L）和混合标准工作液的配制：分别称取10.0mg标准品，用甲醇溶解并定容于100mL棕色容量瓶中，混匀，于4℃下保存。取各单标准储备液适量，用甲醇配制所需浓度的混合标准工作液 （用前配制）。

含0.1mol／L EDTA的Mcllvaine缓冲溶液的配制：称取12.9g柠檬酸，27.5g磷酸氢二钠与37.2g乙二胺四乙酸二钠，溶于水中并定容至1L，pH＝（4±0.05）。

1.3 样品采集

于2012年3月采集石河子市某污水处理厂初沉池的活性污泥，所有活性污泥样品均采自表层 （0～15cm）。用锡箔纸将样品包裹后进行冷冻干燥，经研磨后过80目筛，转移至密封玻璃瓶中于－20℃保存。

1.4 高效液相色谱－电喷雾串联质谱测定条件

1.4.1色谱条件

Waters Symmetry－C18色谱柱 （150mm ×2.1 mm，3.5μm，美国 Waters公司）；柱温40℃；进样量10μL；流速0.2mL／min；流动相：乙腈（A）＋0.3%甲酸水溶液（B）。梯度洗脱条件：0～1min，15%A～20%A，保持1min；2～10min，20%A～30%A；10～17min，30%A～15%A，保持9min。

1.4.2电喷雾串联质谱条件

电喷雾正电离源 （ESI＋）；毛细管电压为4.5 kV；鞘气压力为25Arb，辅助气压力为8Arb，气体均为高纯氮气；碰撞室出口电压为2.0V，碰撞气为氩气；离子传输毛细管温度350℃；扫描模式：选择反应监测 （SRM）；每对离子扫描时间为0.01s。

每种抗生素的质谱检测参数见表1。

表1 12种目标抗生素的质谱检测条件Tab.1 Experimental parameters of electrospray ionization tandem mass spectrometry for 12antibiotics

1.5 样品前处理方法

1.5.1提取

准确称取2.0g样品（精确至0.01g）置于50 mL离心管中，依次加入0.2g Na2EDTA、50μL of 1μg／L 替代标准（CIP－d8，SMZ－d4与 DMC）和30 mL乙腈－0.1mol／L EDTA－Mcllvaine提取液（V∶V＝1∶1），涡旋混合1min；在40℃下超声萃取15min，然后以3000r／min转速离心5min，取上层清液；重复上步操作2次，合并3次操作收集的提取液并用纯水稀释至300mL，用0.45μm玻璃纤维滤膜过滤。

1.5.2净化

将Oasis MCX （3mL，60mg）和 Oasis HLB（6 mL，200mg）SPE小柱串联，以8mL甲醇和8mL水活化。将稀释后的萃取液以3mL／min的速度通过串联萃取柱之后用10mL的纯水淋洗萃取柱，弃去全部流出液；然后在负压下抽干萃取柱，最后依次用6 mL甲醇和6mL含2%氨水的甲醇洗脱。将洗脱液氮吹浓缩至近干，加入甲醇定容至1mL，经0.22μm针式滤器过滤后进行HPLC－MS／MS测定。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱－串联质谱测定条件的优化

2.1.1液相色谱条件的优化

在 HPLC－ESI－MS／MS分析检测中，不同的流动相对分析物的保留时间、峰形以及检测灵敏度等都有很大影响。本研究分别考察了甲醇－0.3%甲酸溶液、甲醇－0.3%乙酸铵溶液、乙腈－0.3%甲酸溶液与乙腈－0.3%乙酸铵溶液作为流动相时12种目标物分离度和相应信号。实验发现：与甲醇相比，乙腈作为流动相时信号较稳定，可获得更好的色谱峰形；乙酸铵会使TCs的峰形严重拖尾，而采用0.3%甲酸体系则可同时使3类目标分析物的响应值显著增加，信噪比提高很多。为保证流动相的分离效果，实验最终确定乙腈－0.3%甲酸溶液为流动相。

2.1.2质谱条件的优化

根据目标分析物的分子结构及理化性质，采用电喷雾电离源（ESI），在正离子扫描下以选择反应监测模式（SRM）进行分析。采用针泵进样，分别进行Q1和Q3扫描确定定性定量离子对，并对碰撞能等质谱检测参数进行优化（表1），使信号稳定、灵敏度最高。在选定的色谱条件下接入流动相，进而对离子源和离子喷雾电压等参数进行优化。

图1为优化条件下12种目标化合物标准物质（100μg／L）的总离子流图。

图1 12种目标化合物的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 12antibiotics

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1提取液优化

在复杂基质样品中多种目标物的提取过程中，不同的提取方式对提取效率有很大的影响。王硕等［12］比较了USE和ASE两种常见的提取方式对污泥中50种药物的提取效率，结果表明这2种提取方式对SAs和QNs的提取效率相似，另外，由于TCs热解析温度低，ASE提取方式不能从污泥中提取出TCs。因此本实验采用USE提取方式，对比了乙腈－水（25∶75）、甲醇－柠檬酸缓冲液和乙腈－EDTAMcllvaine缓冲液等不同溶剂作为提取液时对实验结果的影响。结果表明：乙腈－EDTA－Mcllvaine作为提取剂时，可将污泥样品中3类12种抗生素全部提取出来，SAs、TCs和QNs 3类抗生素的回收率分别为83%～109%、78%～92%和80%～103%，而且比乙腈－水（25∶75）和甲醇－柠檬酸缓冲液作提取液时的整体回收率都高。其原因可能是：活性污泥中含有天然有机质（如腐植酸）和金属离子等，许多抗生素易与金属离子鳌合，影响提取效率，利用EDTA－Mcllvaine缓冲液能有效地阻止抗生素与样品中金属离子的鏊合作用。因此，以乙腈－EDTA－Mcllvaine为提取剂时提取效果较好。

2.2.2固相萃取柱的选择

由于目标分析物的酸碱性和极性差异比较大，本实验比较了HLB、MCX和C18三种不同的SPE小柱的富集效果，结果如图2所示。

图2 不同固相萃取柱对12种抗生素回收率的影响Fig.2 Influence of different solid phase extraction columns on recoveries of 12antibiotics

由图2可知：目标物经过HLB柱后，QNs与TCs的回收率均高于70%；MCX柱对SAs的回收率较高；而C18小柱对12种目标物的回收率均略低。为提高12种目标物的整体萃取效率，实验中将MCX和HLB两种萃取柱串联对12种目标物进行萃取。结果表明：串联柱对SAs、QNs和TCs三类分析物的平均回收率均高于HLB、MCX和C18三种萃取柱单独使用时的富集效果，且回收率稳定、重现性好，因此，本实验选用MCX和HLB串联柱对污泥样品进行富集、净化。

2.2.3洗脱液的选择

本实验考察了不同洗脱液对12种目标抗生素洗脱效果的影响。在300mL的自来水中加入100 μL混合标准工作溶液（1μg／mL），经 MCX 3mL，60mg）和 HLB（6mL，200mg）SPE串联小柱富集，10mL纯水淋洗，负压下抽干萃取柱，分别以6mL的甲醇、含2%氨水（体积比）的甲醇以及含10%丙酮的甲醇3种不同试剂洗脱。结果表明：以甲醇作为洗脱剂时，TCs可获得较高的回收率，SAs和QNs整体的洗脱效果都不佳；含2%氨水的甲醇对SAs和QNs的洗脱效果较好，而TCs在碱性条件下不稳定导致其回收率较低。因而，本实验先用甲醇再用2%氨水的甲醇对12种目标物进行洗脱。

2.2.4浓缩方法优化

常用的浓缩方法有氮气浓缩与旋转蒸发浓缩，本研究利用含1%氨水的甲醇配制了10mL不同浓度 （1、50与100ng／L）的混合标准工作溶液，比较两种浓缩方法对12种目标物回收率的影响。结果表明，使用氮气浓缩时12种目标物回收率均略微高于旋转蒸发法，且所有分析物的回收率都大于83%。因此，本实验选用氮气浓缩法。

2.3 方法学确证

2.3.1线性范围和检出限

在选定的色谱和质谱条件下，对一系列不同浓度的混合标准溶液（0.5μg／L～250μg／L）进行分析。以待测组分定量离子对的峰面积进行定量，得到12种分析物检测的标准曲线的线性方程、线性范围及相关系数等参数，结果见表2。

由表2可知：12种化合物均在较宽的范围内具有良好的线性（r2＞0.990），TCs、QNs及SAs三类目标抗生素的检出限（LOD，S／N＝3）分别为0.25 μg／kg～1.13μg／kg、0.11μg／kg～0.42μg／kg及0.33μg／kg～1.15μg／kg，都低于潘寻等［14］建立的污泥样品中多种SAs和TCs检测方法的检出限（1 μg／kg～16μg／kg）。

表2 12种抗生素的线性回归方程、线性范围、相关系数（r2）及检出限（LOD，S／N＝3）Tab.2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients（r2）and limits of detection（LOD，S／N＝3）of 12antibiotics

2.3.2方法的精密度与准确度

在2g空白活性污泥样品中，分别进行50μg／kg和200μg／kg二个浓度水平的加标回收实验，按1.5节所述方法对样品进行处理，每个加标水平取6份平行样，考察方法的回收率和重现性，结果见表3。

由表3可知：本文采用的前处理方法具有较好的精密度与准确度。在2个加标水平上12种目标物在活性污泥中的平均回收率为63.17%～102.83%，相对标准偏差（RSD）（n＝6）为1.28%～9.30%。

表3 目标抗生素的加标回收率和相对标准偏差（RSD）（n＝6）Tab.3 Spiked recoveries and relative standard deviations（RSD）of the target compounds（n＝6）

2.4 实际样品分析

采用优化的样品前处理条件和 HPLC－MS／MS分析条件，对石河子市某污水处理厂初沉池表层活性污泥样品进行分析，结果见图3。

图3显示：除LOM外，其他目标分析物在所有样品中均被检出。TCs、QNs及SAs三类抗生素的浓度范围分别为21.50μg／kg（TC）～143.75μg／kg（OTC）、nd（LOM）～115.23μg／kg（CIP）及1.81μg／kg（SAAM）～24.28μg／kg（SDZ）；总浓度分别为：247.08 μg／kg、148.94μg／kg及50.00μg／kg。

图3 石河子市某污水处理厂活性污泥中12种抗生素的含量Fig.3 Concentrations of 12antibiotics in the activated sludge of municipal sewage treatment plants in Shihezi

3 结论

1）本文采用 USE、SPE与 HPLC－MS／MS联用技术建立了活性污泥中3类共12种抗生素类药物残留的分析方法。样品经乙腈与EDTA－Mcllvaine缓冲溶液超声萃取；Oasis MAX与HLB串联固相萃取柱富集净化，然后依次以甲醇和含2%氨水的甲醇溶液洗脱；以乙腈和0.3%甲酸水溶液为流动相进行 HPLC－ESI－MS／MS分析。

2）该方法易于操作，适用于污水处理厂活性污泥中多种抗生素的分析和监测，为进一步研究其在环境中迁移转化提供了支持。

3）应用该方法，在石河子市某污水处理厂活性污泥中检测到TCs、QNs及SAs三类抗生素的总浓度分别为：247.08μg／kg、148.94μg／kg及50.00 μg／kg。

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