杀伤性CD4+ T细胞与原发性肝细胞癌疾病进展的相关性研究

周霖，王华明，福军亮，陈艳，李元元，陈黎明，吕飒，王福生

既往对CD4+T细胞的关注，主要集中于其在特异性免疫应答中的辅助功能，如通过分泌不同的细胞因子参与和调节体液免疫及细胞免疫应答，而有关CD4+T细胞杀伤功能的相关研究结果都来自于体外培养的CD4+T细胞系或者细胞克隆[1-3]。最近越来越多的研究发现，在小鼠和人体外周血中都可不经诱导直接检测到一群表达杀伤性颗粒的CD4+T细胞，并且这群细胞通过颗粒酶和穿孔素途径发挥了直接的溶细胞作用。但目前对CD4+杀伤性T细胞(CTL)在人类疾病中的数量变化特点了解尚不够深入。基于此，我们对原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma，PHCC)患者外周血中的CD4+杀伤性T细胞数量进行了比较分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 入选病例为2009年10月－2011年9月解放军302医院收治的临床确诊为PHCC的患者99例，同时纳入年龄性别匹配的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者28例，健康对照40例。各组患者和健康对照的基本情况见表1。所有PHCC病例均为在慢性乙型肝炎基础上合并肝癌。肝癌诊断标准符合2001年9月第8届全国肝癌学术会议(广州)制定的原发性肝癌临床诊断标准[4]，CHB诊断标准符合2010年《慢性乙肝防治指南》[5]。所有病例及对照均经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb，并排除其他肝炎病毒感染及合并自身免疫性、酒精性肝病等。同时行血常规、肝功能检测。入组所有病例及对照均签署知情同意书。

表1 各组患者和健康对照一般情况Tab.1 General information of subjects enrolled in present study

1.2 主要试剂和仪器 流式细胞仪(Calibur型)、CD3-PerCP、CD4-APC、颗粒酶A-FITC、颗粒酶BFITC、穿孔素-FITC、破膜剂均购自美国BD公司。乙肝病毒血清标志物ELISA检测试剂盒由北京科卫试剂有限公司提供。

1.3 CD4+CTL检测方法 采用流式细胞术检测颗粒酶A、B及穿孔素阳性的CD4+T细胞，即为CD4+CTL。同时取3份新鲜分离的PBMCs各5×105个置于流式管，加入PBS洗涤1遍后悬于200μl PBS，加入荧光标记抗体CD3-PerCP、CD4-APC，4℃避光孵育20min，PBS洗涤1次，加入破膜剂300μl，4℃避光30min，离心后弃上清，加入破膜洗液1ml，洗涤后，分别加入颗粒酶A-FITC、颗粒酶B-FITC、穿孔素-FITC，4℃避光孵育20min，破膜洗液洗涤1次后悬于200μl PBS，1%多聚甲醛固定，4℃保存，24h内用流式细胞仪检测，应用CELLQuest软件收获细胞并分析。

1.4 不同人群外周血CD4+CTL的比较 PHCC患者99例、CHB患者28例和健康对照40例，均取外周血5ml，按1.3的方法进行操作，采用流式细胞术检测CD4+CTL和CD4+T细胞总数，计算CD4+CTL所占比例。

1.5 不同分期PHCC患者外周血CD4+CTL的比较

根据诊断标准[3]将99例PHCC患者分为早期(Ⅰ期，n=29)、中期(Ⅱ期，n=36)、进展期(Ⅲ期，n=34)3组。检测患者CD4+CTL和CD4+T细胞总数，计算CD4+CTL所占比例，比较早、中期和晚期患者细胞比例的差异。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。不同人群和不同分期PHCC患者外周血CD4+CTL的比例为计量资料，满足正态分布，以s表示。健康对照、CHB患者及PHCC患者表达颗粒酶A、B和穿孔素的细胞占CD4+T细胞比例以百分率表示，由于3组方差不齐，故采用Kruskal-Wallis H非参数检验进行比较，组间两两比较采用Mann-Whitney U非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PHCC、CHB和健康对照组外周血CD4+CTL比例的比较 统计学分析显示，PHCC患者外周血表达颗粒酶A、B和穿孔素的细胞比例显著高于CHB组和健康对照组(P＜0.05)，其余两组间差异无统计学意义(表2，图1)。

2.2 不同分期PHCC患者外周血CD4+CTL比例的比较 随疾病进展，CD4+CTL占CD4+T细胞的比例显著下降。各期患者CD4+CTL的比例和统计学分析结果见表3。

3 讨 论

近年来越来越多的证据显示CD4+CTL可能通过杀伤作用发挥重要的抗肿瘤作用[6-7]。但是CD4+CTL在人类肿瘤中的研究较少，尤其是其在肿瘤发生发展过程中的变化情况国内鲜见报告。本研究通过直接检测CD4+CTL颗粒酶和穿孔素的表达来鉴定CD4+CTL，可以更为精确地反映CD4+CTL的数量，并方便观察其在肝癌中的变化特点[1-3]。

表2 外周血颗粒酶A、B和穿孔素阳性CD4+ CTL细胞比例Tab. 2 Proportion of Granzyme A+, Granzyme B+ and perforin CD4+ cytotoxic T lymphocytes in peripheral blood of patients with NC, CHB or PHCC

图1 外周血CD4+ CTL细胞典型流式细胞图Fig. 1 Typical figure of flow cytometry showing CD4+cytotoxic cells in peripheral blood

慢性HBV感染及其引起的长期反复肝脏炎症损伤，导致了慢性肝炎向肝硬化和肝癌进展[8]。既往研究证实，与健康人相比，CHB患者CD4+CTL数量的增加并无统计学意义[9]，本研究也并未发现CHB患者和健康对照之间存在显著差异。所以，我们认为HBV感染并非引起HCC患者CD4+CTL数量增加的主要原因，而肿瘤发生很可能是首要原因。另外，传统杀伤性细胞如CD8+CTL、NK细胞等的功能受抑有可能诱导机体免疫系统进行补充性反馈，导致CD4+T细胞表达杀伤性颗粒，行使杀伤功能。

有研究发现，肝癌组织内96%的淋巴细胞处于无反应状态，只有很少的CD8+T细胞表达颗粒酶和穿孔素[10-11]。本实验室既往研究也证实，肝癌患者的NK细胞和CD8+T细胞的杀伤功能可能受Treg的抑制[11-12]。早在10多年前，Williams等[13]就发现在缺少活化的CD8+T细胞的情况下，CD4+T细胞能够引发穿孔素依赖的杀伤作用。

表3 PHCC各期患者外周血CD4+ 杀伤性T细胞频率Tab. 3 Proportion of Granzyme A+, Granzyme B+ and perforin+ CD4+ cytotoxic T lymphocytes in peripheral blood of PHCC patients at different stages

研究显示，在慢性病毒性肝炎和自身免疫性疾病中，长期慢性炎症可能是诱导CD4+CTL生成的重要原因[2,12]，而炎症也贯穿着肿瘤性疾病发生发展的全过程，与肝癌患者的预后密切相关[14-16]。因此，炎症导致的免疫活化可能是PHCC患者CD4+CTL数量增加的重要原因之一。

在以上结果的基础上，本研究发现早期肝癌患者CD4+CTL数量升高，但随疾病进展，其数量反而显著减少。我们推测，在肿瘤发生早期，机体免疫监视功能发挥作用，诱生CD4+T细胞的杀伤功能，发挥抗肿瘤作用。但随着疾病进展，肿瘤诱导的免疫抑制增强，机体抗肿瘤免疫功能逐渐削弱，CD4+CTL的数量也随之减少。当然，这一推测还需大量的研究工作来证明。

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